Articolo metodologico

Un modello murino di irreversibile e reversibile unilaterale Ureteric Ostruzione

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DOI:

10.3791/52559

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20 dicembre 2014

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1MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh

In questo articolo

Sommario

Il modello murino di ostruzione ureterale unilaterale irreversibile (UUO) viene presentato insieme al modello di UUO reversibile in cui l'ostruzione ureterale viene alleviata dall'anastomosi dell'uretere reciso nella vescica. Questi modelli consentono lo studio dell'infiammazione renale e delle cicatrici, nonché del rimodellamento dei tessuti.

Abstract

L'ostruzione del rene può interessare i reni nativi o trapiantati e provoca lesioni renali e cicatrici. Qui viene presentato un modello di nefropatia ostruttiva indotta da ostruzione ureterale unilaterale (UUO), che può essere irreversibile (UUO) o reversibile (R-UUO). Nel modello UUO irreversibile, l'uretere può essere ostruito per periodi di tempo variabili al fine di indurre un'infiammazione renale sempre più grave e cicatrici fibrotiche interstiziali. Nel modello reversibile R-UUO l'uretere è ostruito per indurre idronefrosi, dilatazione tubulare e infiammazione. Dopo un adeguato periodo di tempo, l'ostruzione ureterale viene quindi invertita chirurgicamente mediante anastomosi dell'uretere precedentemente ostruito alla vescica al fine di consentire la completa decompressione del rene e il ripristino del flusso urinario alla vescica. Il modello UUO irreversibile è stato utilizzato per studiare vari aspetti dell'infiammazione e della cicatrizzazione renale, tra cui la patogenesi della malattia e la sperimentazione di potenziali terapie antinfiammatorie o antifibrotiche. Il modello più impegnativo di R-UUO è stato utilizzato da alcuni ricercatori e offre un significativo potenziale di ricerca in quanto consente lo studio dei processi infiammatori e immunitari e del rimodellamento dei tessuti in un rene danneggiato e cicatrizzato dopo la rimozione dello stimolo dannoso. Di conseguenza, il modello R-UUO offre ai ricercatori l'opportunità di esplorare la risoluzione dell'infiammazione renale insieme agli aspetti chiave della riparazione tissutale. Questi modelli sperimentali sono rilevanti per la malattia umana in quanto i pazienti spesso presentano un'ostruzione del tratto renale che richiede la decompressione e sono comunemente lasciati con una significativa compromissione renale residua che non ha opzioni di trattamento attuali e può portare a un'eventuale insufficienza renale allo stadio terminale.

Introduzione

L'obiettivo generale del modello sperimentale qui descritto è quello di indurre la nefropatia ostruttiva mediante ostruzione ureterale unilaterale (UUO), che può essere irreversibile (UUO) o reversibile (R-UUO). Viene presentato un modello semplice e irreversibile di UUO in cui l'uretere sinistro è ostruito in modo permanente dalla legatura con una sutura o dall'applicazione di una clip di legatura. Ciò si traduce in una marcata dilatazione dell'uretere insieme a una riduzione del flusso sanguigno renale e della filtrazione glomerulare. L'istologia renale mostra dilatazione tubulare e infiammazione renale interstiziale e fibrosi sempre più gravi. L'UUO irreversibile è un modello utile ed è stato adottato da molti ricercatori nello studio sia dell'infiammazione renale che della fibrosi. 1-4 Sebbene il modello irreversibile di UUO richieda una certa competenza chirurgica, è relativamente semplice e viene spesso utilizzato per cercare informazioni sulla patogenesi del danno renale interstiziale e della conseguente fibrosi. Viene presentato anche un modello R-UUO meno frequentemente utilizzato utilizzando una modifica del metodo originariamente descritto da Tapmeier et al. 5 Il modello R-UUO ha un grande potenziale futuro per lo studio dei processi infiammatori e immunitari, della rigenerazione cellulare e tissutale, nonché del successivo rimodellamento tissutale a seguito della rimozione di uno stimolo dannoso.

Il modello R-UUO, più impegnativo, è stato utilizzato da un numero limitato di ricercatori, con alcuni gruppi che impiegano una tecnica chirurgica significativamente diversa da quella qui descritta6,7, anche se con risultati interessanti. Nel modello R-UUO presentato, l'uretere è legato per indurre l'ostruzione ureterale completa per un periodo di tempo sufficiente a indurre il livello di lesione e fibrosi desiderato: 7 giorni di UUO sono stati scelti nel metodo qui descritto. L'ostruzione ureterale viene invertita e il rene viene lasciato decomprimere per un periodo di tempo determinato dallo sperimentatore prima che i topi vengano abbattuti e il rene rimosso per l'analisi: 7 giorni di decompressione sono stati scelti nel metodo qui descritto, anche se un periodo più lungo sarebbe stato scelto se si stesse studiando la risoluzione dell'infiammazione e della fibrosi. Sebbene il metodo qui descritto richieda una notevole esperienza chirurgica, offre diversi vantaggi rispetto ad altri modelli R-UUO. L'applicazione di un tubo di plastica a parete morbida sull'uretere ostruito impedisce un'eccessiva dilatazione ureterale e questo facilita la successiva manipolazione e anastomosi dell'uretere. Inoltre, nel modello R-UUO descritto l'uretere viene diviso permettendo così la rimozione di eventuali residui di sedimento urinario e detriti. Ciò conferma che il lume dell'uretere rimanente è de-ostruito e pervio prima dell'anastomosi alla vescica.

Gli esperimenti che incorporano sia i modelli UUO irreversibili che reversibili possono fornire ai ricercatori una potente comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari sia del danno che della successiva risoluzione e rigenerazione. Pertanto, il modello di R-UUO qui descritto sarebbe molto rilevante per i ricercatori interessati al rimodellamento tissutale post-infiammatorio e a come questo possa essere modulato.

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Protocollo

Guida Generale: Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti imposti dagli Animali (Procedure Scientifiche) Act 1986. Questo protocollo e il protocollo video che accompagna sono sia un UUO standard e un R-UUO, che può essere eseguita su molti ceppi di topi. Nel video che accompagna, entrambe le procedure sono effettuate su maschi C57BL / 6 topi di età compresa tra 8 settimane. I dati presentati nella sezione risultati rappresentativi sono stati ottenuti da maschi FVB / n topi.

NOTA: Questo protocollo e accompagnamento dettagli video come eseguire un UUO standard R-UUO utilizzando dell'uretere sinistro, ma le stesse tecniche possono essere facilmente applicati al dell'uretere destra.

1. Preparazione animali e laparotomia

  1. Eseguire tutte le procedure con (autoclave) gli strumenti e materiali di consumo sterili.
  2. Iniettare ketamina cloridrato (70 mg / kg) e cloridrato medetomidina (1mg / kg) per via intraperitoneale per anestetizzareil mouse. Nota: La durata del piano anestetico risultante è 4 ore e non necessita di anestesia supplementare.
  3. Confermare la profondità dell'anestesia dalla perdita di riflessi, per esempio pizzico punta.
  4. Rimuovere tutti i capelli che circonda l'area di incisione e preparare la pelle per la chirurgia addominale mediante applicazione di una soluzione diluita di clorexidina.
  5. Posizionare il mouse su un tappetino riscaldato chirurgica in posizione supina e fissare gli arti al pad con bassa aderenza del nastro adesivo.
  6. Durante la procedura, monitorare il mouse per segni di ustioni a causa del pad chirurgica riscaldato. Se possibile utilizzare una fonte di calore non elettriche.
  7. Amministrare analgesico da una iniezione sottocutanea di buprenorfina cloridrato (0.06mg / kg) e applicare il lubrificante occhio per evitare l'essiccazione della cornea.
  8. Effettuare una laparotomia mediana e una incisione delle alba avascolare Linea usando forbici tessuto separazione per ottenere l'accesso alla cavità peritoneale.
  9. Proietta il mouse e inserire un colibririavvolgitore nella incisione.

2. unilaterale Ureteric Ostruzione

  1. Usando bastoncini di cotone sterilizzati esporre dell'uretere sinistro spostando l'intestino verso il lato destro della cavità addominale e coprirli con teli inumiditi.
  2. Utilizzando pinze ad angolo isolano e sollevare dell'uretere sinistro.
  3. Per creare una ostruzione ureterale, legare dell'uretere sinistro due volte con 6 / O nera intrecciata sutura di seta ovunque tra la vescica e pelvi renale. Per gli esperimenti a lungo termine, di utilizzare suture assorbibili per tutti gli interventi chirurgici addominali. In alternativa, una clip di legatura può essere applicato dell'uretere.
  4. Per isolare la vescica dal dell'uretere, dividere l'uretere tra i due punti di sutura.
  5. Ricollocare accuratamente l'intestino nella cavità peritoneale.
  6. Seguire le istruzioni di cui alla sezione 4 - recupero post-operatorio e cura per chiudere l'incisione e invertire la anestesia.

3. Preparazione Reversible unilaterale Ureteric Ostruzione

  1. Preparare un mouse per la chirurgia e isolare dell'uretere sinistro come descritto nei passaggi 1,1-2,2 sopra.
  2. Per creare una ostruzione ureterale che può essere invertito, legare l'uretere sinistro due volte con 6 / O nero intrecciato sutura di seta vicino alla vescica. Lasciare una estremità della sutura superiore finché questo sarà utilizzato per ancorare il tubo di plastica morbida murato in luogo intorno dell'uretere.
  3. Effettuare una feritoia longitudinale in una lunghezza di 5 mm di tubazione di plastica morbida murata tale che possa essere strombato aperto per permettere di essere applicato al dell'uretere. Qualsiasi tubazione di plastica morbido silicone murata, con un diametro interno di 1 mm e diametro esterno di 2 mm, può essere utilizzato.
  4. Posizionare il tubo di plastica murato morbida dolcemente intorno l'uretere. Assicurarsi che il lungo sutura emerge dal centro della fessura nel tubo una volta chiuso attorno dell'uretere.
  5. Mettere una lunghezza di 6 / O nera intrecciata sutura di seta attorno al tubo murato morbido che racchiude l'uretere e cravattauna volta. Ora posizionare l'estremità lunga della sutura, emergente dal centro della fessura nel tubo, longitudinalmente attraverso il tubo in modo da giacere sopra della sutura precedentemente legato.
  6. Legare la sutura si trova attorno al tubo per due volte per ancorare il tubo e la fine lunga sutura sul posto intorno al uretere.
    Nota: Per evitare la formazione di adesione su dell'uretere e il tubo di plastica morbida murata, una soluzione di riduzione adesione può essere applicato alla zona attorno al tubo.
  7. Ricollocare accuratamente l'intestino nella cavità peritoneale.

4. Post-Operative recupero e cura

  1. Chiudere il peritoneo con punto coperta con 5 / O nera intrecciata sutura di seta e approssimare la pelle con clip pelle metallica.
  2. Per minimizzare il rischio di infezioni post-operatorie, applicare tale antisettico come soluzione di iodio / alcool alla pelle addominale.
  3. Parzialmente anestesia indietro con cloridrato atipamezolo (2 mg / kg) per via sottocutanea.
  4. Somministrare fluidi da una iniezione sottocutanea di 1 ml di soluzione salina riscaldato.
  5. Monitorare il mouse fino a che non ha recuperato la coscienza.
  6. Lasciare il mouse per recuperare in una scatola riscaldata mantenuto a 29 ° C per 24 ore. Cibo umido può essere fornita anche per incoraggiare l'assunzione di liquidi e la nutrizione.
  7. Lasciare il mouse per recuperare per indurre un livello desiderato di ostruzione, tipicamente 7 giorni.
  8. Per gli esperimenti di recupero a lungo termine, fornire analgesici in corso. Se il mouse è da recuperare per più di 7 giorni, rimuovere le clip di pelle 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  9. Una volta che il livello desiderato di ostruzione è stata indotta, sia invertire la UUO, come descritto di seguito, o eutanasia il mouse per dislocazione cervicale e raccogliere i reni per l'analisi istopatologica.

5. reversibile unilaterale Ureteric Ostruzione

  1. Per eseguire un R-UUO preparare un topo, che ha subito la preparazione per la R-UUO, per la chirurgia come descritto ai punti 10,1-1,7.
  2. Se presente, rimuovere i fermagli pelle e dividere o rimuovere le suture nel peritoneo per accedere alla cavità addominale. Nota: Se l'uretere è stato ostacolato per un lungo periodo clip pelle esperimento avrebbe dovuto essere rimosso 7 giorni dopo l'applicazione.
  3. Preparare il mouse e isolare dell'uretere sinistro come descritto nei punti 1,8-2,2.
  4. Utilizzando pinze ad angolo, liberare il tubo di plastica morbida murato da qualsiasi tessuto granulomatoso che si possono formare.
  5. Tagliare la sutura tenendo il tubo di plastica intorno l'uretere ostruito con un bisturi e rimuovere il tubo.
  6. Conferma successo UUO valutando la presenza di idronefrosi nel rene sinistro, il rene dovrebbe apparire pallido.
  7. Dividete l'uretere tra le suture.
  8. Posizionare la lunghezza rimanente dell'uretere, attaccato al rene, su un piccolo pezzo di garza sterile. Questo verrà utilizzato per raccogliere il sedimento urinario e cellule morte che si scarica dal dell'uretere unnd pelvi renale volta la sutura viene rimosso.
  9. Dividere l'uretere sopra, ma vicino, la sutura e consentire il rene di drenare sulla garza. Lasciare la sutura inferiore, più vicino alla vescica, intatta. Questo per garantire che nessun urina fuoriuscire dalla vescica e nella cavità peritoneale.
  10. Una volta che l'uretere e pelvi renale sono state drenato applicare una lunga 6 / O nero intrecciato sutura di seta alla fine della lunghezza rimanente dell'uretere. Questo sarà usato per aiutare l'uretere per anastomosi vescica eseguita successivamente.
  11. Seguire i passi di seguito per anastomosi la durata residua del uretere nella vescica:
    1. Ruotare l'uretere tale che si trova anteriormente alla sua posizione originale e si trova sopra il rene.
    2. Inserire un singolo 9 / O poliammide monofilamento incollamento sutura 2 mm dal terminale dell'uretere tale che emerge nella direzione della vescica. Fare attenzione al fine di garantire che la sutura rimane nella tunica muscolare e non entra il lume uretere. Il wil virata sutural essere utilizzato per ancorare l'uretere nella vescica.
    3. Per creare un canale attraverso la vescica, passare un ago 21G diagonalmente attraverso la vescica tale che esce verso il frontale (ventrale) parete della vescica.
    4. Resto un ago eyed nella smussatura dell'ago 21G. Utilizzare l'ago 21G per guidare l'ago occhi attraverso la vescica. L'ago occhi sarà usato per prendere l'uretere attraverso la vescica.
    5. Passare il 9 / O incollamento sutura, applicato al dell'uretere nel passaggio 5.11.2, attraverso la prima incisione nella vescica e fuori attraverso la parete della vescica adiacente al punto di ingresso. Una volta che l'uretere viene fatto passare attraverso la vescica sarà legato per ancorare l'uretere alla vescica.
    6. Posizionare la lunga 6 / O intrecciato nero sutura di seta applicata all'estremità dell'uretere nel passaggio attraverso l'ago 5.10 occhi.
    7. Sfilare delicatamente l'ago occhi fuori della vescica assicurando al contempo che l'uretere è anche tirato attraverso la vescica.
    8. Una volta che l'uretere emerge da the vescica rimuovere l'ago occhi e applicare un morsetto alla lunga sutura alla fine dell'uretere per impedire retrazione nella vescica.
    9. Per ancorare l'uretere all'interno posto nella vescica, legare il 9 / O poliammide monofilamento tack sutura, applicato in fase 5.11.5.
    10. Applicare unici aggiuntivi 9 / O poliammide suture monofilamento cravatta come descritto nei punti 5.11.2 e 5.11.5 a due posizioni intorno al punto di ingresso per ancorare saldamente l'uretere all'interno della vescica.
    11. Utilizzando la parte posteriore di forbici aperte, spingere la parete della vescica leggermente indietro per esporre più dell'uretere emergente.
    12. Dividere dell'uretere sopra lungo sutura situato all'estremità dell'uretere. L'uretere deve rientrare nel corpo della vescica. Si è soliti osservare urine scorre fuori dall'apertura nella vescica, confermando il lume aperte dell'uretere.
    13. Chiudere l'uscita avvolto nella vescica con una poliammide sutura monofilamento 9 / O.
  12. Ricollocare accuratamente l'intestino inla cavità peritoneale.
  13. Fornire assistenza post-operatoria, come descritto nei passaggi 4,1-4,8.
  14. Lasciare che il mouse per recuperare fino a quando il rene viene decompresso, tipicamente 7 giorni.
  15. Al punto finale sperimentale, eutanasia il mouse dislocazione cervicale e raccogliere i reni per l'analisi istopatologica.

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Risultati

L'aspetto delle modifiche renali marcatamente seguente ostruzione degli ureteri e diventa pallido e teso alla palpazione con il tempo (Figura 1). Vi è una crescente dilatazione dell'uretere prossimale all'ostruzione e pelvi renale. Il rene diventa sempre atrofica come la durata della nefropatia ostruttiva aumenta con ostruzione prolungata con conseguente notevole assottigliamento della corteccia renale e midollare. Dopo l'inversione di ostruzione ureterale, il colore del rene diventa più...

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Discussione

L'ostruzione del rene può interessare i reni nativi o trapiantati e provoca lesioni renali e cicatrici. Il modello R-UUO è rilevante per la malattia umana in quanto i pazienti spesso presentano un'ostruzione del tratto renale secondaria a ipertrofia prostatica, valvole uretrali posteriori, ecc. che richiede la decompressione con pazienti comunemente lasciati con una significativa compromissione renale residua che non ha opzioni di trattamento attuali e può eventualmente portare a malattia renale allo stadio terminale.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno concorrenti o conflittuali interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

Il presente studio è stato supportato da sovvenzioni di Kidney Research UK (ST4/2011), Cunningham Trust (CT11/14), Mrs AE Hogg Charitable Trust for Kidney Research e Renal Endowment Fund of the Royal Infirmary of Edinburgh.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Forbici da dissezione smussateFine Science Tools14072-10
Forbici a molla - dritteFine Science Tools15000-10
Pinze dentateFine Science Tools11021-12
Pinze angolate x 2Fine Science Tools00649-11
Pinze dritteFine Science Tools00632-11
Divaricatore a filo Colibri da 3 cmFine Science Tools17000-03
Porta aghi Castroviejo con bloccoFine Science Tools12565-14
Applicatore di clip per feriteFine Science Tools12031-07
Clip per ferite da 7 mmFine Science Tools12032-07
Porta aghi micro Castroviejo con bloccoFine Science Tools12060-01
Microscopio OPMI picoCarl ZeissS100
Pad elettronico termicoCozee Comfortn/a
6/O sutura intrecciata in setaHarvard Apparatus72-3287
9/O Sutura Dafilon (poliammide)B-BraunG1111434
5/O sutura in seta intrecciataHarvard Apparatus51-7680
Ago smussato regolare, 1 pollice, 21GBecton, Dickinson and Company305175
1 ml punta antiscivoloBecton, Dickinson and Company300184
Tamponi di carta WypallKimberley-ClarkL40Sterilised (Autoclave)
Cotton fiocJohnson and Johnsonn/aSterilised (Autoclave)
Tende sempliciGuardianCB03Sterilizzato (Autoclave)
Tubo in gomma siliconicaTubo in silicone - diametro interno 1,0 mm; diametro esterno 2,0 mm; spessore della parete 0,6 mm
(Lacri-Lube) Paraffina morbida bianca 57,3%, olio minerale 42,5% e alcoli di lanolina 0,2%Allergan Ltd21956GB10X
(Videne) Iodio povidone 10%Ecolab LtdPL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamina cloridratoPfizer Animal HealthVm 42058/4165100mg/ml soluzione
(Domitor) Medetomidina cloridratoOrion PharmaVm 06043/40031mg/ml
(Vetergesic) Bupernorfina cloridratoAlsto Animal HealthVm 00063/40020,3mg/ml
(Antisedan) Atipamezolo idrocorrideOrion PharmaVm 06043/40045mg/ml
(Adept) 4% IcodestrinaBaxterSoluzione di riduzione dell'adesione
NaCl 0,9%BaxterFKE1323
siringa da a parete morbida

Riferimenti

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