Articolo metodologico

Un idrogel Costruire e fibrina-based Glue approccio per fornire Therapeutics in una murino Myocardial Infarction Model.

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DOI:

10.3791/52562

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14 giugno 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo mira ad alleviare la limitazione dello scarso attecchimento cellulare per il trattamento con cellule staminali degli infarti del miocardio attraverso l'uso di un sistema di idrogel e di una colla a base di fibrina. Con questo approccio, il contatto cellula-tessuto dopo l'infarto può essere mantenuto, aumentando il potenziale terapeutico degli agenti benefici nel sito della lesione.

Abstract

Il modello murino MI è ampiamente riconosciuto nel campo delle malattie cardiovascolari ed è stato costantemente utilizzato come primo passo per testare l'efficacia dei trattamenti in vivo1. Il protocollo tradizionale e consolidato è stato ulteriormente perfezionato per ridurre al minimo i danni all'animale. In particolare, gli strati muscolari pettorali vengono allontanati piuttosto che semplicemente tagliati e la toracotomia viene affrontata intercostalmente invece di rompere le costole in una sternotomia, preservando l'integrità della gabbia toracica. Con questi cambiamenti, lo stress complessivo sull'animale diminuisce.

Le terapie con cellule staminali volte ad alleviare i danni causati dagli infarto miocardico si sono dimostrate promettenti nel corso degli anni per i loro benefici pro-angiogenici e anti-apoptotici. Gli attuali approcci di consegna delle cellule sulla superficie del cuore prevedono tipicamente l'iniezione delle cellule vicino al sito danneggiato, all'interno di un'arteria coronaria o nel flusso sanguigno periferico2-4. Sebbene le cellule abbiano dimostrato di ospitare il miocardio danneggiato, la funzionalità è limitata dal loro scarso attecchimento nel sito della lesione, con conseguente diffusione nel flusso sanguigno5. Questo manoscritto evidenzia una procedura che supera questo ostacolo con l'uso di un cerotto idrogel incapsulato con cellule. Il cerotto viene fabbricato prima della procedura chirurgica e viene posizionato sul miocardio lesionato immediatamente dopo l'occlusione dell'arteria coronaria sinistra. Per far aderire il cerotto in posizione, la colla di fibrina esterna biocompatibile viene posizionata direttamente sopra il cerotto, consentendone l'asciugatura sia sul cerotto che sulla superficie del cuore. Questo approccio fornisce un nuovo metodo di adesione per l'applicazione di un delicato costrutto terapeutico di incapsulamento cellulare.

Introduzione

Un infarto del miocardio (MI) è definito come l'interruzione di sangue ad una regione del cuore causata dalla occlusione di un'arteria coronaria. Il danno derivante da un MI è dovuto al rimodellamento del tessuto cardiaco vitale in tessuto cicatriziale non funzionale, che diminuisce la capacità del cuore o, più specificamente, il ventricolo sinistro, per battere correttamente. Ciò si traduce in una diminuzione del volume di sangue che può essere consegnato al corpo ad ogni battito cardiaco, chiamata volume ictus, e la percentuale di sangue che viene pompato dal cuore ad ogni battito cardiaco, noto come frazione di eiezione 6. Questi, insieme ad altre funzioni diminuita, aumenta la tensione sul resto del cuore per mantenere la funzione adeguata. Spesso, questo aumento ceppo può diventare così grave che provoca un secondo attacco cardiaco, un fenomeno visto in circa il 10% degli individui 7.

Mentre le pratiche mediche si sono evoluti per trattaresubito dopo un infarto miocardico, nessuna tecnica è stata sviluppata per fermare, rallentare o invertire gli effetti collaterali negativi di rimodellamento tissutale. Terapie con cellule staminali sono emersi come una possibile via per un tale trattamento, tuttavia, nonostante il loro potenziale promettente, le cellule staminali non hanno dimostrato con successo in ambito clinico. Una teoria le loro carenze è l'incapacità di garantire le cellule benefiche rimangono nella sede dell'infarto abbastanza lungo per generare risultati favorevoli 5. È stato dimostrato che non più del 24% di cellule che sono semplicemente iniettato nel sito di infarto sopravvissuto, rimanendo al primo danneggiata sito: 1 giorno post-parto 2. Una possibile prospettiva per affrontare la questione della conservazione delle cellule è quello di sviluppare sistemi di idrogel biocompatibile che incapsulano sia cellule o terapeutica, che possono essere consegnati al sito danneggiato. L'idrogel di scelta in questo protocollo è un poli (glicole etilenico) dimetacrilato grazie al suo impiego precedente incapsulamento della pila procedures, tuttavia, qualsiasi idrogel grado di incapsulamento può essere utilizzato 8. La consegna della patch direttamente al sito di lesione assicura il contatto cellula-tessuto per un periodo prolungato di tempo, aumentando la lunghezza di tempo le cellule possono fornire fattori positivi al miocardio sottostante.

Un collo di bottiglia per l'approccio patch è la difficoltà di aderire il cerotto alla superficie del cuore. Molti gruppi hanno superato questo attraverso una varietà di tecniche, i più diffusi essendo una semplice sutura per legare il costrutto alla superficie cardiaca 9,10. Questo si è dimostrato efficace in un numero di casi in cui il costrutto è fatto di un materiale più rigido, ma non riesce quando tentato su un sistema idrogel, a causa della concentrazione di acqua ad alta e delicata natura del costrutto patch. Per ovviare a questo, abbiamo utilizzato una colla di fibrina sistema adesivo esterno che imita la chimica di formazione del coagulo. Colla di fibrina è stata utilizzata in numerosi studi medici, incLuding lacrime Dura, fistole bronchiali, e trapianto di cornea, mettendo in evidenza la biocompatibilità del prodotto come sigillante ferita 11-13. Inoltre, la fibrina è stato utilizzato per una varietà di scopi cardiache, compreso il trattamento chirurgico delle fratture del ventricolo sinistro e coronarici chirurgia di bypass, tuttavia, il suo uso come una colla adesione per una patch cardiaca non è comunemente usato 14-17. Una semplice formulazione di trombina e fibrinogeno risultati in una colla biocompatibile che può essere posizionato direttamente sulla parte esterna di un cerotto cardiaco esterno, fornendo un sistema di aderenza sostenibili in modo cerotto all'interazione cuore.

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Protocollo

La procedura è in piena compatibilità con numero di protocollo IACUC 13302 ed è stato approvato dalla divisione delle risorse animali.

1. Strumento Preparazione

  1. Autoclavare tutti gli strumenti non monouso utilizzati prima della procedura chirurgica per garantire la sterilità.
  2. Sterilizzare gli strumenti utilizzati più volte in una sessione con una sterilizzatrice perle di vetro tra usi.

2. Hydrogel Preparazione

  1. Scongelare e le cellule staminali piatto almeno 24 ore prima della creazione del costrutto idrogel.
  2. Preparate patch un giorno prima l'intervento chirurgico utilizzando un apparato stereolitografia (o uno strumento simile) che è stato descritto in dettaglio in precedenti pubblicazioni 8,18.
  3. Per creare l'idrogel, prima di generare una progettazione assistita da computer (CAD) modello del patch desiderato ed esportare il design in formato stereolitografia (STL).
  4. Creare una soluzione pre-gel per dissolving di poli (etilenglicole) dimetacrilato (PEGDMA) in PBS sterile 1x per ottenere 20% w / v soluzione. Contemporaneamente, sciogliere il fotoiniziatore 1- [4- (2-idrossi etossi) fenil] -2-idrossi-2-metil-1-propan-1-one in DMSO. Aggiungere il fotoiniziatore alla soluzione PEGDMA ad una finale w / v di 0,5%. Direttamente prima reticolazione, aggiungere 100 ml di densità di celle desiderato. Nota: Una densità delle cellule tra 2,0 x 10 5 -2.0 x 10 6 cellule / ml è raccomandato.
  5. Pipettare la soluzione pre-gel in un piatto al centro della piattaforma SLA ed eseguire il software SLA con la STL formattato disegno già caricato.
  6. Rimuovere le patch dall'apparato incubare idrogel O / N a modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con siero 5% bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina per consentire cellule per regolare per l'ambiente all'interno della patch.

3. Preparazione degli animali e intubati oralesu

  1. Valutare ogni mouse prima della procedura per garantire che l'animale è in buona salute, come determinato dalle loro abitudini di toelettatura e le interazioni con i loro compagni di gabbia. Nota: femmina 8-10 settimane di età C57BL / 6J sono stati usati per questa procedura, però, può essere utilizzato qualsiasi età mouse o tipo.
  2. Inserire animali in una camera anestetico ed esporre al 5% isofluorano con un supporto 1 L / min O 2. Monitorare il livello di anestesia da pizzico piedi reflex.
  3. Una volta che l'animale sia adeguatamente anestetizzato, pesare e metterli sul supporto intubazione.
  4. Dirigere una sorgente di luce verso cavità toracica dell'animale e utilizzare pinze per ritrarre la superficie della laringe ed esporre le corde vocali. Guidare con attenzione un G angiocath 20 tra le corde vocali, e senza intoppi inserire nella trachea. Controllo corretto inserimento da un movimento meccanico della cavità toracica una volta che il catetere è collegato al piccolo ventilatore animali.
  5. Regolare le impostazioni di ventilazione a the peso dell'animale base alle linee guida del produttore.
  6. Una volta intubato, mettere l'animale in posizione supina su una piastra elettrica per evitare l'ipotermia. Assicurarsi che il pad di riscaldamento non superi i 40 ° C. Se necessario, posizionare una barriera tra l'animale e il pad di riscaldamento per ridurre al minimo il rischio di ustioni.
  7. Rimuovere capelli dal sito chirurgico attraverso l'uso di una crema depilatoria. Sterilizzare il sito da 3 scrub alternati di betadine e il 75% di etanolo per garantire una corretta sterilizzazione. Posizionare un drappo per esporre solo il sito chirurgico e posizionare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura.

4. Procedura chirurgica

  1. La toracotomia viene eseguita sul lato sinistro dell'animale, quindi, fare una incisione cutanea circa 1 cm a sinistra dello sterno, che corre lungo sterno.
  2. Utilizzare pinze per separare lo strato muscolare della gabbia toracica sottostante in due fasi. Osservare una DelineLinea DELL'INDICE DI che rappresenta gran pettorale muscoli dell'animale. Sollevare questo muscolo un po ', separarlo dal sottostante muscolo obliquo esterno e ritrarre mediale. Poi, liberare il muscolo obliquo esterno dalla gabbia toracica sottostante nello stesso modo, e retrarre lateralmente, fornendo una vista accessibile del secondo, terzo, e quarto costole.
  3. Eseguire la toracotomia tra la terza e la quarta costola. Sollevare delicatamente la quarta costola e utilizzare un cauterizer per aprire la cavità toracica tra la terza e quarta costola. Posizionare divaricatori per aprire ulteriormente la cavità ed esporre il cuore.
  4. Utilizzare pinze per rompere il sottile pericardio del cuore.
  5. Legare l'arteria coronaria sinistra con una sutura in nylon 8-0 monofilamento. Posizionare la sutura circa 4 mm dalla punta del cuore, direttamente sotto la punta inferiore dell'atrio sinistro. Determinare il corretto posizionamento di sutura da un pallore del miocardio ventricolare ed un aumento delle dimensioni dell'atrio sinistro dopo la Suture è stato legato.

5. Patch Placement e colla

  1. Mantenere patch a 37 ° C e 5% CO 2 condizioni fino al momento dell'uso.
  2. Sollevare delicatamente la patch con una spatola ended piana e posizionare delicatamente sulla superficie del cuore, nel sito di infarto.
    Nota: per evitare di scivolare fuori dal ventricolo sinistro, la patch può essere tenuto in posizione da mantenere leggermente contatto utilizzando la spatola o la punta di un paio di pinze.
  3. Preparare la colla mescolando un rapporto 4: 1 di fibrinogeno in trombina. Miscelare la soluzione pipettando ripetutamente finché comincia ad addensarsi, di solito entro 1 minuto dopo l'inizio della preparazione.
  4. Una volta che la viscosità della soluzione raggiunge il livello desiderato, trasferire rapidamente circa 10 ml alla superficie patch. Nota: Il tempo di coagulazione della colla di fibrina è rapido, fornendo una piccola finestra di opportunità per un efficiente trasferimento della colla.

6. sutura

  1. eseguire tutti i punti di sutura di chiusura con una sutura in nylon 6-0 monofilamento.
  2. Chiudere lo strato costola con 3-4 singoli punti staccati.
  3. Prima chiusura completa dello strato intercostali, inserire una cannula PE-10 nell'incisione per evacuare la cavità toracica dopo la chiusura è completa e ristabilire la corretta pressione intrapleurica.
  4. Chiudere i muscoli pettorali con 3-4 singoli punti staccati.
  5. Sigillare lo strato di pelle con una sutura continua.
  6. Dopo completa chiusura, collegare una siringa 1,0 ml al termine della cannula e utilizzarlo per evacuare la cavità toracica.
  7. Applicare un tessuto adesivo al sito di incisione per rinforzare il sito di sutura.

Trattamento 7. post-chirurgico

  1. Dare topi un'iniezione di buprenorfina (0,05-1,0 mg / kg) e carprofen (2,2 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo la legatura coronarica e almeno 20 minuti prima del risveglio. Somministrare entrambi i farmaci 6-8 ore dopo l'intervento chirurgico, E poi dare due volte al giorno per un massimo di tre giorni per controllare il dolore e angoscia.
  2. Monitorare costantemente gli animali fino consapevole e ogni ora, per la prima dopo l'intervento di 4 ore. Eseguire un secondo controllo la sera della chirurgia (2-4 ore più tardi) per somministrare una seconda dose di analgesico.
  3. Monitorare gli animali ogni giorno dopo il secondo giorno dopo la procedura, fino a quando gli animali appaiono stabili.

8. Analisi di funzionamento del cuore e Istologia

  1. Eseguire ecocardiografi sui topi 4 settimane dopo la procedura per determinare l'entità del danno a seguito del MI.
  2. Anestetizzare topi con 4-5% isoflurano in una camera di anestesia per l'induzione di anestesia per inalazione, e poi 2% isoflurano via maschera per l'anestesia di mantenimento.
  3. Eliminare l'area di esposizione con una crema depilatoria e utilizzare un piccolo animale ultrasuoni per ottenere un 2D M-mode dell'ecocardiografia scansione del cuore pulsante e registrare i parametri funzionali associato con esso.
  4. Euthanize i topi in una camera di anidride carbonica, quindi raccogliere i cuori dagli animali e posto in una soluzione di formalina al 10% per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire i cuori al 70% di etanolo e conservare a 4 ° C fino al trattamento dei tessuti.
  5. Elaborare i cuori e li incorpora in blocchi di paraffina.
  6. Tagliare 5 millimetri sezioni attraverso la regione ventricolare del cuore, partendo all'apice e terminando l'atrio.
  7. Stain fette con entrambi tricromica di Masson e ematossilina e eosina utilizzando protocolli standard sezionato.

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Risultati

Durante la procedura chirurgica, legatura dell'arteria coronarica sinistra può essere identificato da un marcato blanching valle dell'arteria occlusa. Come test prima di sposarsi, la sutura può essere stretto per breve tempo per verificare se è in un luogo adeguato. Inoltre, poiché occlusione delle arterie risultati in diminuzione quasi istantanea nella capacità dell'atrio sinistro per battere correttamente, l'atrio sinistro si allargherà in risposta ad un riflusso di sangue nel sistema.

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Discussione

Con questo approccio al modello MI murino, abbiamo sviluppato un sistema che riduce al minimo il danno alle zone non miocardio che sono associati con altre tecniche MI murine. Queste aree includono danni causati da tracheostomia, il taglio dello strato muscolare, e la rottura delle nervature per esporre la cavità toracica. Crediamo che questi cambiamenti migliorare le generali chirurgici risultato grazie alla cura di mantenere il più delle grandi strutture, compres...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal US Army Grant (W81XWH-08-1-0701) e una borsa di studio da Carle Foundation Hospital.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ventilatore per topi Harvard Model 687Apparecchio Harvard55-0001
Inintech Biosciences LLC Sterilizzatore per perline di vetro seccoFisher ScientificNC9531961
Microscopio operatorio Leica MZ6
GeminiGEM 5917
Pinze delicate - Punte da 0,4 mm Strumenti angolatile scienze fini11063-07
Divaricatore Agricola - 3,5 cm SpreadFine Science Tools17005-04
Forbici a molla - Lame da 2,5 mm DritteFine Science Tools15000-08
Castroviejo Portaaghi - con blocco Carburo di tungsteno 14 cmFine Science Tools12565-14
Forbici Iris - Delicate Dritte 10,5 cmFine Science Tools14060-10
Sutura monofilamento 8-0Ethicon8730P
6-0 Sutura setaEthicon639G
TrombinaSigmaT7009
FibrinogenoSigmaF3879
Adesivo tissutale Vetbond3M1469SB
Kit di cauterizzazione Leica per

Riferimenti

  1. Kolk, M. V., et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2009).
  2. Li, Y., Yao, Y., Sheng, Z., Yang, Y., Ma, G. Dual-modal tracking of transplanted mesenchymal stem cells after myocardial infarction. International journal of nanomedicine. 6, 815-823 (2011).
  3. Nagaya, N., et al. Intravenous administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 287, H2670-H2676 (2004).
  4. Wang, J. S., Shum-Tim, D., Chedrawy, E., Chiu, R. C. The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: pathophysiologic and therapeutic implications. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 122, 699-705 (2001).
  5. Cashman, T. J., Gouon-Evans, V., Costa, K. D. Mesenchymal stem cells for cardiac therapy: practical challenges and potential mechanisms. Stem cell reviews. 9, 254-265 (2013).
  6. Sutton, M. G., Sharpe, N. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: pathophysiology and therapy. Circulation. 101, 2981-2988 (2000).
  7. Smolina, K., Wright, F. L., Rayner, M., Goldacre, M. J. Long-term survival and recurrence after acute myocardial infarction in England, 2004 to 2010. Circulation. Cardiovascular quality and outcomes. 5, 532-540 (2012).
  8. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab on a chip. 10, 2062-2070 (2010).
  9. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta biomaterialia. 10, 2727-2738 (2014).
  10. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  11. Cavallo, L. M., Solari, D., Somma, T., Savic, D., Cappabianca, P. The Awake Endoscope-Guided Sealant Technique with Fibrin Glue in the Treatment of Postoperative Cerebrospinal Fluid Leak After Extended Transsphenoidal Surgery: Technical Note. World neurosurgery. , (2013).
  12. Chung, H. W., Mehta, J. S. Fibrin glue for Gundersen flap surgery. Clinical Ophthalmology. 7, 479-484 (2013).
  13. Dunn, C. J., Goa, K. L. Fibrin sealant: a review of its use in surgery and endoscopy. Drugs. 58, 863-886 (1999).
  14. Chi, N. H., et al. Cardiac repair achieved by bone marrow mesenchymal stem cells/silk fibroin/hyaluronic acid patches in a rat of myocardial infarction model. Biomaterials. 33, 5541-5551 (2012).
  15. Erb, M. A., Claus, T., Hartrumpf, M., Bachmann, S., Albes, J. M. The use of Tachosil surgical patch or fibrin glue in coronary artery surgery does not affect quality of anastomosis or provoke postoperative adhesions in pigs. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 36, 703-707 (2009).
  16. Okada, K., et al. Surgical treatment for rupture of left ventricular free wall after acute myocardial infarction. Interactive cardiovascular and thoracic surgery. 4, 203-206 (2005).
  17. Simpson, D., Liu, H., Fan, T. H., Nerem, R., Dudley, S. C. A tissue engineering approach to progenitor cell delivery results in significant cell engraftment and improved myocardial remodeling. Stem Cells. 25, 2350-2357 (2007).
  18. Jeong, J. H., et al. Living' microvascular stamp for patterning of functional neovessels; orchestrated control of matrix property and geometry. Advanced Materials. 24, 58-63 (2012).
  19. Wu, X., Ren, J., Li, J. Fibrin glue as the cell-delivery vehicle for mesenchymal stromal cells in regenerative medicine. Cytotherapy. 14, 555-562 (2012).

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