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Articolo metodologico

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l'analisi fenotipica e

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DOI:

10.3791/52564

⸱

8 aprile 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per isolare in modo efficiente le cellule T residenti nella pelle da biopsie cutanee umane. Questo protocollo produce un numero sufficiente di linfociti residenti nella pelle umana vitali per l'analisi citofluorimetrica e la coltura ex vivo.

Abstract

La pelle umana ha una importante funzione di barriera e contiene varie cellule del sistema immunitario che contribuiscono a omeostasi tissutale e la protezione da agenti patogeni. Come la pelle è relativamente facile da accesso, fornisce una piattaforma ideale per lo studio periferici meccanismi di regolazione del sistema immunitario. cellule residenti immunitario in buona salute immunosorveglianza condotta della pelle, ma anche svolgere un ruolo importante nello sviluppo di malattie infiammatorie della pelle, come la psoriasi. Nonostante intuizioni emergenti, la nostra comprensione della biologia di base varie malattie infiammatorie della pelle è ancora limitata. Vi è una necessità di una buona qualità popolazioni (singolo) di cellule isolate da campioni di pelle biopsiati. Finora, procedure di isolamento sono stati gravemente ostacolati dalla mancanza di ottenere un numero sufficiente di cellule vitali. Isolamento e successiva analisi sono stati colpiti dalla perdita di marcatori lignaggio cellule immunitarie, a causa dello stress meccanico e chimico causato dalle procedure di dissociazione correnti averesospensione singola cella. Qui, descriviamo un metodo modificato per isolare le cellule T sia da salutare e coinvolto pelle umana psoriasica combinando dissociazione pelle meccanico utilizzando un dissociatore tessuto automatizzato e il trattamento collagenasi. Questa metodologia conserva espressione della maggior parte dei marcatori lignaggio immunitario come CD4, CD8, Foxp3 e CD11c sulla preparazione di sospensioni di cellule singole. Sono mostrati esempi di isolamento successo + T CD4 cellule e successiva analisi fenotipica e funzionale.

Introduzione

La pelle, come l'interfaccia principale tra il corpo e l'ambiente, fornisce la prima linea di difesa contro fisica esterna, chimiche e insulti biologici quali ferite, radiazioni ultraviolette e microrganismi. Pelle è composto da due vani principali, l'epidermide e il derma, e contiene una varietà di cellule del sistema immunitario, tra cui le cellule di Langerhans, macrofagi, cellule dendritiche (DC), e circa 20 miliardi di cellule T di memoria, quasi il doppio del numero di presenti in tutto il volume di sangue 1 , 2. Un numero sempre crescente di dati supporta l'idea che la pelle ha funzioni immunologiche essenziali, sia durante l'omeostasi dei tessuti e in diverse condizioni patologiche. Le cellule immunitarie residenti nella cute normale si pensa di condurre immunosorveglianza 3 e hanno dimostrato di giocare un ruolo nello sviluppo di malattie infiammatorie come la psoriasi 4. Nella cute lesionata psoriasica, sia CD4 + e CD8 + infiltrati cellule T erano osserved ed è stato dimostrato che il rapporto tra il CD4 e CD8 varia a seconda dello stato di malattia 5. Tuttavia, queste popolazioni di cellule sono difficili da studiare perché le tecniche esistenti consentono l'isolamento di solo poche cellule.

Le tecniche attualmente largamente utilizzati per l'isolamento delle cellule T da pelle umana combinano dissociazione pelle meccanica con trattamento enzimatico. Biopsie cutanee umane sono ampiamente tritata e incubate con enzimi come tripsina, collagenasi e / o EDTA 6-8. Considerando che la pelle è un tessuto barriera che è altamente resistente alle forze di trazione e disgregazione meccanica, i metodi stabiliti di isolamento delle cellule T prodotte pochissime cellule, e anche i numeri inferiori di cellule vitali, che rende ex vivo di coltura cellulare di queste popolazioni cellulari difficile e stimolante.

Qui, riportiamo un metodo modificato per isolare i linfociti provenienti sia sano e coinvolto pelle umana psoriasica combinando Mechanla dissociazione iCal della pelle utilizzando un dissociatore tessuto automatizzato invece del metodo stabilito di ampiamente tritare, insieme a digestione enzimatica con collagenasi. sono stati osservati vari sottoinsiemi di cellule immunitarie vitali tra DC e cellule T dopo la preparazione di una cella singola sospensione. È importante sottolineare che l'espressione dei marcatori di superficie CD3, CD4 e CD8 è stato ben conservato. Le cellule così preparate, sono pronte per l'uso in colture cellulari ex vivo o analisi di citometria di flusso. Questo protocollo è stato impiegato con successo per l'analisi di biopsie cutanee singoli (4 mm) derivati ​​dalla cute lesionale di pazienti affetti da psoriasi. I risultati hanno mostrato che le cellule T dei pazienti della pelle residente prodotte citochine infiammatorie come più IL-17 e IFNγ rispetto ai volontari sani 9.

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Protocollo

NOTA: Le biopsie cutanee da individui sani sono stati ottenuti da addominale avanzi pelle di individui sottoposti a chirurgia plastica elettiva dopo consenso informato orale o scritta per uso scientifico. L'uso di pelle umana è stato approvato e in conformità con le norme stabilite dai comitati etici medici per la ricerca umana del centro medico dell'Università Radboud, Nijmegen, Paesi Bassi e dell'Università di Essen, in Germania.

1. Preparazione di sospensioni singola cella dalla pelle umana (lavoro sterile in un flusso-armadietto se successiva coltura cellulare è obbligatorio)

  1. Preparare terreno di coltura cellulare: RPMI 1640 + penicillina / streptomicina (concentrazioni finali 100 unità / ml e 100 mg / ml, rispettivamente) + piruvato (0,02 mm) e Glutamax (0,02 mm), senza siero aggiunto.
  2. Preparare terreno di coltura completo: terreno di coltura preparato al punto 1.1 + 10% di siero umano pool (HPS); Conservare a 4 ° C. Portate medie a 20 ° C ± 2 prima di noiing.
  3. Ottenere la biopsia della pelle utilizzando un round strumento biopsia pugno 4 mm e tenerlo in RPMI1640 terreno di coltura completo a 20 ° C ± 2 per un massimo di 4 ore oppure a 4 ° C ON. Elaborare la biopsia appena possibile all'arrivo in laboratorio.
    NOTA: più lunga conservazione di pelle influenzerà il rendimento delle cellule e la vitalità delle cellule.
  4. Etichettare un tubo blu-capped dissociazione e aggiungere 5 ml di terreno di coltura completo nel tubo etichettati.
  5. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura completo in ogni pozzetto (in totale 3 pozzi) di una piastra sterile cultura 6-bene. Utilizzare strumenti sterili per posizionare la biopsia in un singolo pozzetto, lavare, spostarlo verso un secondo pozzo e ripetere questo passo ancora una volta, ottenendo così un totale di tre risciacqui.
  6. Trasferire la biopsia cutanea ben sciacquati ad una piastra di Petri sterile, aggiungere 100 ml di mezzo di coltura completo sulla parte superiore della biopsia, e con attenzione raschiare il tessuto adiposo sottocutaneo utilizzando un bisturi sterile monouso acciaio inox.
    NOTA: Thè è un passaggio fondamentale.
  7. Tagliare ogni biopsia cutanea in 4 pezzi più piccoli su una piastra di Petri sterile. campioni di trasferimento (fino a quattro di biopsie di 4 mm per tubo) al tubo di dissociazione preparato contenente 5 ml di terreno di coltura completo.
  8. Chiudere bene le provette con il tappo, e collegare testa in giù per la manica del dissociatore tessuti automatizzato. Assicurarsi che tutto il materiale di esempio si trova nella zona del rotore.
  9. Avviare il processo di dissociazione eseguendo il "programma di m_spleen _01" (un programma predefinito fornito dalla memoria interna dello strumento o tramite la carta del programma accompagnati) per dissociare la biopsia alla velocità di rotazione appropriato per 56 sec.
  10. Dopo l'elaborazione, staccare il tubo di dissociazione dal dissociatore e assicurarsi che tutto il materiale dissociato viene raccolto sul fondo della provetta.
  11. Aggiungere 150 microlitri collagenasi IA (80 mg / ml) nel tubo di dissociazione e incubare il campione in un bagno d'acqua a 37° C per 60 min. Aggiungere 100 ml di DNasi I (5 MU / ml) nel tubo thedissociation, mescolare bene.
    NOTA: maggiore concentrazione di collagenasi o il tempo di incubazione più lungo altererà la vitalità delle cellule.
  12. Fissare il tubo di dissociazione al manicotto del dissociatore tessuti automatizzati ed eseguire il "programma di m_ milza _01" dissociare la biopsia ancora una volta.
  13. Inserire un 70 mM colino cella nylon sulla parte superiore di un tubo Falcon 50 ml. Applicare materiali campione dissociati a questo filtro per rimuovere cellule grumi di cellule / tessuti detriti.
  14. Lavare setaccio cellule una volta con 5 ml di terreno di coltura completo. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 10 minuti e aspirare il surnatante.
  15. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. pellet cellulari risospendere in 300 ml di terreno di coltura completo. cella singola sospensioni sono pronti per ulteriori analisi; continuare con protocolli per colture cellulari ex vivo o citometria a flusso di analisi.
  16. In caso di ulteriore intracellular citochina colorazione, stimolare cellule con PMA (12,5 ng / ml), Ionomicina (500 ng / ml) e brefeldina a (5 mg / ml) per 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 4 ore prima di eseguire il flusso analisi di citometria.

2. Polyclonal attivazione delle cellule T della pelle-residente (Ex Vivo Cell Culture)

  1. Aliquota sospensioni monocellulari 100 pl (preparata al punto 1.15) in un piatto fondo rotondo a 96 pozzetti.
    NOTA: Per ciascuna mm biopsia 4 pelle, le sospensioni monocellulari acquisiti possono essere suddivisi in almeno due pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
  2. Aggiungere anti-CD3 / anti-CD28 mAb microsfere rivestite (25.000 perle per bene), ricombinante citochina umana rIL-2 (concentrazione finale 25 U / ml) e rIL-1b (concentrazione finale 50 ng / ml).
  3. Coprire la piastra di coltura con un coperchio piatto ben etichettato-, incubare 5% di CO 2, 100% di umidità, 37 ° C incubatore. Cambiare media quando il colore medio si trasforma in giallo.
    Nota: Una colonia a cellule chiare si può osservare dal giorno 8 di coltura cellulare.

3. Citometria a flusso Analisi di primaria / coltura le cellule della pelle-Resident T

  1. Preparare FACS buffer: PBS + 0,2% di BSA.
  2. Trasferire le cellule di interesse in una piastra a 96 pozzetti v-bottom. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  3. Risospendere il pellet in 100 ml di PBS. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  4. cellule macchia con 100 ml di eFluorescence780 preparati coniugati risolvibile colorante vitalità (1: 1000 diluizione utilizzando PBS) a 4 ° C per 30 min. Aggiungere 100 pl di tampone FACS, centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  5. Scegliete il termine anticorpi monoclonali marcatore di superficie delle cellule, per esempio: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 01:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1,10), e CD1c-APC (AD5-8E7, 1,10), preparare gli anticorpi monoclonali miscela utilizzando tampone FACS in base ad ogni fattore di diluizione mAb testato. Definire le impostazioni del cancello utilizzando il controllo isotipo di anticorpo insieme con il campione non macchia.
  6. Aggiungere 25 ml di anticorpi monoclonali preparato miscela in ciascun pozzetto. Incubare 20 minuti a 20 ° C ± 2, proteggere dalla luce.
  7. Aggiungere 100 pl di tampone FACS, centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  8. Per i campioni che richiedono soltanto la superficie di colorazione delle cellule, continuare con il passo 3.16.
  9. In caso di intracellulare colorazione Foxp3:
    1. Preparare fissazione e tampone permeabilizzazione miscelando una parte di concentrato con 3 parti di diluenti.
    2. Preparare buffer di permeabilizzazione 1x: 1 parte di 10x permeabilizzazione tampone + 9 parti di H 2 O. sterilizzato
  10. pellet Risospendere in 100 ml di fissazione e permeabilitampone zione, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 30 min.
  11. Aggiungere 100 microlitri di buffer permeabilizzazione a ciascun pozzetto, centrifugare a 450 xg a temperatura ambiente per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  12. Lavare le cellule con tampone permeabilizzazione ancora una volta.
  13. Selezionare anticorpi monoclonali intracellulari necessario, ad esempio, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) e IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Preparare l'impasto mAbs utilizzando tampone permeabilizzazione contenente 2% di siero normale di ratto in base ad ogni fattore di diluizione mAb testato. Definire le impostazioni del cancello utilizzando il controllo isotipo di anticorpo insieme con il campione non macchia.
  14. Aggiungere 20 ml di preparato MAB-composto in ogni pozzetto. Incubare a 4 ° C per 30 minuti, al riparo dalla luce.
  15. Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere 100 ml di tampone permeabilizzazione in tutti i pozzetti. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  16. Lavare le cellule con permeabilizzazione BuffeR ancora una volta. Risospendere il pellet in 110 ml di buffer di FACS, e sospensioni cellulari trasferimento in tubo microFACS.
    NOTA: Il campione è pronto per la misurazione della citometria a flusso a 10 colori.
  17. In caso di numero di cellule esatta richiesta, aggiungere 10 ml di sospensione uniforme ben miscelato di fluorosfere in ciascun campione immediatamente prima di eseguire misurazioni di citometria a flusso.

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Risultati

Il protocollo presentato qui produrrà tra 2.200 ± 615 (media ± SEM, pelle di volontari sani) fino a 178.000 ± 760 (media ± SEM, cute lesionata dei pazienti affetti da psoriasi) linfociti vitali da pelle umana quando si utilizza un singolo 4 millimetri biopsia cutanea.

Diversi tipi di CD45 + cellule sono state identificate in cella singola sospensioni derivate dalla pelle di individui sani, tra cui CD4 + T-cellule (~ 45%), CD8 + T-cellule (~ 30%), e CD11c

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Discussione

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare in modo efficace le cellule T della pelle residenti da biopsie cutanee umane. Il vantaggio di questo protocollo è l'isolamento del numero relativamente elevato di linfociti vitali, ed esprimendo marcatori di superficie rilevanti. I sottoinsiemi di cellule identificate sono state: le cellule, CD11c + DCs CD4 + e cellule T CD8 + e Foxp3 + CD25 +. È importante sottolineare che, ex vivo coltura di cellule T dell...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

biopsie cutanee da pazienti affetti da psoriasi sono stati gentilmente forniti dal Dr. Andreas Koerber (dipartimento di Dermatologia presso l'Università di Essen, Germania) dopo il consenso orale o scritta informato per uso scientifico.

XH è anche supportato da NSFC 61.263.039 e 11.101.321 NSFC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Punzone monouso per biopsiaKai EuropeBP-40F4 mm
Bisturi sterili monousoDalhausen1100000510
delicataMACS C tuboMiltenyi Biotech130-093-237Tappo blu, utilizzato come tubo di dissociazione.
gentleMACS DissociatoreMiltenyi Biotech130-093-235Dissociatore tissutale automatizzato. Utilizzo del "programma spleen_01" per la dissociazione della biopsia cutanea.
Filtro cellulare BD35235070 & m piastra
con fondo a U a 96 pozzettiin nylon Greiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
Piruvato di sodioLife Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Penicillina/streptomicinaLife Technologies15140-122
Umano Siero aggregato (HPS)preparato
Collagenasi ISigma-AldrichC2674Tipo 1-A, adatto per colture cellulari
DNasi ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
Colorante di vitalità fissabile (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18Colorare le cellule morte prima della fissazione cellulare; diluire con PBS a 1:1.000
Concentrato di fissazione/permeabilizzazioneeBioscience00-5123-43
Diluente di fissazione/permeabilizzazioneeBioscience00-5223-56
Tampone di permeabilizzazione (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 Clone di CD45 BD 563879 anti-umano di topo: HI30; fattore di diluizione 1:50
FITC Topo anti-umano CD14DakoT0844Clone: TUK4; fattore di diluizione 1:50
PE Topo anti-umano CD56DakoR7127Clone: MOC-1; fattore di diluizione 1:50
ECD Topo anti-umano CD3Beckman - CoulterA07748Clone: UCHT1; fattore di diluizione 1:50 per colorazione superficiale; fattore di diluizione 1:25 per colorazione intracellulare.
PC5.5 Topo anti-umano CD4Beckman - CoulterB16491Clone: 13B8.2; fattore di diluizione 1:200
PeCy7 Topo anti-umano CD11cBeckman - CoulterA80249Clone: BU15; fattore di diluizione 1:50
APC Topo anti-umano CD1cMiltenyi Biotech130-090-903Clone: AD5-8E7; fattore di diluizione 1:10
APC-AlexFluo700 Topo anti-umano CD8Beckman - CoulterA66332Clone: B9.11; fattore di diluizione 1:400
APC-AlexFluo750 Topo anti-umano CD19Beckman - ColtroA94681Clone: J3-119; fattore di diluizione 1:50
PeCy7 Topo anti-umano CD25eBioscienceAD5-8E7Clone: BC96; fattore di diluizione 1:50
  PE Ratto anti-umano CLAMiltenyi Biotech130-091-635clone: HECA-452; fattore di diluizione 1:
eFluo450 Rat anti-umano Foxp3eBIoscience48-4776-42Clone: PCH101; colorazione intracellulare; fattore di diluizione 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17AeBioscience53-7179-42Clone: eBio64DEC17; colorazione intracellulare; fattore di diluizione 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNgeBioscience25-7319-41Clone: 4S. B3; colorazione intracellulare; fattore di diluizione 1:400
Fluorosfere a flussoBeckman - Coulter7547053Sfere di conteggio, per citometria a flusso
in casa

Riferimenti

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