Articolo metodologico

Design, Trattamento delle superfici, Cellular placcatura, e Coltura di neuronali modulari reti composte di circuiti funzionalmente interconnessi

DOI:

10.3791/52572

⸱

15 aprile 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel-Aviv University, 2Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 3School of Electrical Engineering, Tel-Aviv University, 4School of Physics and Astronomy, Tel-Aviv University, 5Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering, University of Genova

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto descrive un protocollo di crescere in vitro reti modulari composti da spazialmente confinate, circuiti neuronali funzionalmente interconnessi. Una maschera polimerica viene usata per modello uno strato proteico per favorire l'adesione cellulare su substrato di coltura. Neuroni placcato crescono su aree rivestite stabilire connessioni spontanee e che presentano attività elettrofisiologica.

Abstract

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Il cervello opera attraverso l'attivazione coordinata e la comunicazione dinamica di assiemi neuronali. Un importante questione aperta è come un vasto repertorio di motivi dinamici, che sono alla base funzioni cerebrali più diverse, può emergere da un'organizzazione topologica fissa e modulare di circuiti cerebrali. Rispetto a studi in vivo di circuiti neuronali che presentano difficoltà intrinseche sperimentali, preparati in vitro offrono una possibilità molto più grande di manipolare e sondare le proprietà strutturali, dinamiche e chimiche dei sistemi neuronali sperimentali. Questo lavoro descrive un metodo sperimentale in vitro che permette crescente di reti modulari composti da spazialmente distinte, assemblee di neuroni funzionalmente interconnessi. Il protocollo consente il controllo bidimensionale (2D) architettura della rete neuronale a diversi livelli di complessità topologica.

Un patterning rete desiderata può essererealizzato sia su vetrini regolari e substrato integrato array micro elettrodi. Strutture microlavorati sono impressi su un wafer di silicio e usati per creare matrici polimeriche biocompatibili, che incorporano le caratteristiche negative della architettura di rete desiderato. Le matrici sono disposte sui substrati di coltura durante la procedura di rivestimento con uno strato molecolare per promuovere l'adesione cellulare. Dopo la rimozione delle matrici, i neuroni sono placcati e spontaneamente reindirizzato alle zone rivestite. Diminuendo la distanza inter-vano, è possibile ottenere circuiti neuronali o isolate o interconnessi. Per promuovere la sopravvivenza delle cellule, le cellule sono co-coltura con una rete neuronale supporto che si trova alla periferia del piatto di coltura. Registrazioni elettrofisiologiche e ottiche di attività delle reti modulari ottenuti rispettivamente mediante substrato integrato micro schiere di elettrodi e di imaging di calcio sono presentati. Mentre ogni modulo mostra SPONTsincronizzazioni globali aneous, il verificarsi di sincronizzazione tra moduli è regolata dalla densità di collegamento fra i circuiti.

Introduzione

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Evidenze sperimentali e teorici sostengono la possibilità che il cervello opera attraverso l'attivazione coordinata di gruppi di cellule 1-5, che può essere considerato come unità funzionali dinamici che transientemente interagiscono tra loro, sagomatura e sottostanti diversi stati cerebrali. Modularità funzionale dipende anche e associato con l'organizzazione modulare strutturale dei circuiti cerebrali 6,7. Come funzione e la struttura dei circuiti cerebrali reciprocamente forma l'altro è ancora una delle principali questioni aperte nel campo delle neuroscienze. Per fornire una comprensione più approfondita di questa domanda, è importante identificare quadri sperimentali ottimali dove è possibile affrontare, almeno parzialmente, tali problemi. Dal controllo manipolazione delle dinamiche spazio-temporali delle reti neuronali in esperimenti in vivo è impegnativo, lo sviluppo di modelli in vitro reti neuronali è di notevole interesse per la loro facile accessibility, il monitoraggio, la manipolazione e modellazione 8,9. Negli ultimi anni, nel settore delle tecnologie in vitro sostenute da metodi di substrato patterning avanzati hanno permesso di indurre le reti neuronali per sviluppare una gamma di strutture modulari predefinite 3 e per studiare le proprietà funzionali delle reti con topologie imposti 10. In particolare, i metodi sono stati recentemente utilizzati per organizzare reti imponendo vincoli fisici 4,11. Infatti, per studiare il legame tra struttura e funzione nelle reti neuronali e per fornire una rappresentazione semplificata ma plausibile di interagire assiemi neuronali, sistemi in vitro dovrebbero fornire neuronali sottopopolazioni interconnessi. Omogenei colture neuronali ampiamente studiato 2D non impongono vincoli spaziali sul cablaggio emergenti auto-organizzato dei circuiti. Quindi un possibile approccio per modellare gruppi di cellule artificialmente interconnessi è di posizionare diverse popolazioni neuronali in battibeccoaree distinte buona resa. La distanza tra queste zone non impedisce i collegamenti assemblee interrelazioni. Questo approccio, pur garantendo un controllo notevole sopra complessità della rete, ha dimostrato di fornire un repertorio ricco di modelli di sincronizzazione 6,7,12.

Al fine di facilitare una coltura riproducibile di gruppi neuronali modulari, un protocollo per assemblare l'auto-organizzazione di reti in cluster neuronali collegati da assoni e dendriti è presentato e descritto. La struttura polimerica per il confinamento fisico di colture neuronali è stato creato da polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS è un elastomero ampiamente utilizzati per applicazioni biomediche grazie alla sua biocompatibilità, la trasparenza e la permeabilità ai gas 13. Il PDMS è preparato e escluso dalla SU8 micromachined 2075 14,15 strutture da-spin rivestimento a PDMS liquido su un "maestro" come descritto in precedenza in Jackman et al. 16 THa raggiunto modellato reti neuronali sono composti da moduli di diverse dimensioni interconnesse e che sono stati ottenuti con successo su entrambi i vetrini e Micro Electrode Array (MEA) 17-20. La densità delle connessioni tra i moduli può cambiare le caratteristiche della sincronizzazione di rete, da una rete completamente sincronizzato, tipica delle culture uniformi, a stati transitori di sincronizzazione tra i moduli.

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Protocollo

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La procedura è stata effettuata in conformità con le norme NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dall'Università Cura e uso Comitato Tel-Aviv animali (numero di permesso - L-14-019).

1. Preparazione degli strumenti e PDMS

  1. Preparare il wafer (Table of Materials, o ordinare il wafer da un laboratorio di microfabbricazione), un bisturi, e un paio di pinzette - la sterilizzazione non è necessario.
  2. Preparare la soluzione di poli-D-lisina (PDL) secondo le seguenti condizioni: 4 mg / ml in 0,1 M tampone borato, pH 8, e conservare a -20 ° C.
  3. Preparare stencil PDMS secondo la seguente procedura:
    1. Preparare polidimetilsilossano (PDMS, elastomero siliconico) miscelando la base e il vulcanizzante con un rapporto di 10: 1, quindi agitare le sostanze 2 per circa 5 min.
    2. Mettere in camera a vuoto due volte per 15 minuti ogni volta e verificare le bolle sono andati.
    3. Quandoil PDMS è pronto, preparare rotazione coater: manopole azoto aperte per consentire l'utilizzo del gas, posizionare il wafer di silicio (Figura 1A) sul filatore, e utilizzare il vuoto per evitare che si muova.
    4. Versare PDMS su wafer e attivare il filatore per 1 min a 1000 rpm (crea circa 100 micron altezza).
    5. Inserire wafer su una piastra calda a 100 ° C per 30 min.
    6. Quando il PDMS è indurito, delineare i confini del stencil con PDMS, con pipetta Pasteur. Inserire wafer su una piastra calda a 100 ° C per 30 min.
    7. Quando i confini PDMS hanno indurito, utilizzare un bisturi per tagliare gli stampini in base ai confini e staccare lo stencil di silicio dal wafer (PDMS un quadrato contenente un singolo modello).

2. Petri Dish e copertura di slittamento Preparazione

  1. Preparare 23 millimetri scivola copertura di vetro quadrato e pulirli secondo il seguente ordine:
    1. Lavare con acqua distillata, 70% di etanolo e acetone.
    2. Lavare con isopropanolo e asciugare velocemente con azoto.
  2. Posizionare fantasia PDMS stencil su coprioggetto, e premere delicatamente per verificare che siano saldamente attaccati alla superficie del vetro. Porre in camera a vuoto per 15 min.
  3. Depositare 1 ml di PDL su stencil. Inserire il vetrino nella camera a vuoto per due volte per 20 minuti ogni volta, e lasciare PDL O / N a secco.
  4. Preparare capsula di Petri per creare una rete di cellule di supporto:
    1. Coprire la superficie del piatto (3,5 cm) con 1 ml di PDL per 2 ore a RT. Rimuovere la goccia Pdl con una pipetta.
    2. Lavare con acqua distillata e lasciare asciugare. Mettere una piccola goccia di grasso al silicone su ogni angolo del vetrino.
  5. Posizionare il vetrino al centro del piatto Petri (cioè, le PDMS devono essere rivolti verso l'alto) e premere delicatamente per verificare l'attaccamento.
  6. Rimuovere delicatamente PDMS dal coprioggetto con una pinzetta. Per la sterilizzazione, esporre a illuminazione UV per 7 min.
Le "> 3. Multi-Electrode Array (MEA) Preparazione

  1. Clean MEA in questo ordine (Table of Materials):
    1. Lavare con acqua sotto rubinetto e sonicare in un detergente enzimatico concentrato 3 volte.
    2. Sonicare in acqua distillata per 3 volte.
    3. Lavare con acqua distillata (in cappa, 1.000 punta microlitri) per 3 volte e posto sotto UV per 30 min.
  2. Sostenere la preparazione di rete:
    1. Preparare lo stampo rete di supporto progettato.
      1. Versare PDMS in una piastra 12 pozzetti (22 mm di diametro).
      2. Quando il PDMS è indurito estrarre lo stampo ed utilizzando un bisturi, tagliare un foro nel mezzo per creare una forma ad anello.
      3. Inserire uno stampo rete di supporto progettata sul centro del MEA (Figura 2A) e coprire il resto della superficie con PDL per 2 ore a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere PDL con pipetta e lavare con acqua distillata.
    3. Togliere lo stampo e lasciare asciugare (figura 2A).
  3. Allineare stencil al MEA nel seguente modo:
    1. Mettere stencil su designato micro manipolatore. Utilizzare un microscopio invertito per allineare con precisione struttura modellata agli elettrodi, e abbassare la matrice finché non viene posto sulla superficie MEA (Figura 2B).
      Nota: Il contatto con un MEA ben pulita fornisce adesione concorrenziali tra le PDMS e MEA stesso.
    2. Sollevare il micromanipolatore e, se necessario, utilizzare una pinzetta per applicare una piccola quantità di pressione sopra i PDMS per evitare che il distacco dal MEA.
    3. Premere delicatamente stencil sulla superficie MEA, e utilizzare il microscopio per verificare che sia saldamente collegato, e ben allineata. (Figura 2C-D).
  4. Inserire MEA in camera a vuoto per 15 min; mettere una goccia 1 ml di PDL su stencil.
  5. Inserire nella camera a vuoto 2 volte per 20 minuti ciascuno. Lasciare asciugare PDL O / N in incubatrice.
  6. Prima di placcatura, rimuovere le PDMS stencil da MEA e lavare con sterili wAter. Mettere sotto illuminazione UV per 7 min.

4. Dissection e Cultura

  1. Preparare le culture come descritto in Herzog et al. 2011 21.

5. placcatura

  1. Calcolare il numero di cellule necessarie per la placcatura, utilizzando un emocitometro (densità ottimale in base alle dimensioni del circuito come discusso nel risultato).
    1. Assicurarsi che la camera di conteggio (emocitometro) è pulito e mettere un vetrino su di esso (l'uso di alcol per la pulizia).
    2. Diluire 10 ml di sospensione di cellule in 190 microlitri di placcatura medio (diluizione 1:20).
    3. Carico 10 microlitri di cellule diluite sul bordo della camera di conteggio e lentamente pipettare le cellule che permetta la camera di riempimento stesso.
    4. Utilizzando un microscopio invertito, visualizza la griglia emocitometro. Determinare il numero di cellule nella camera mediante conteggio diretto (cellule sane dovrebbero essere rotondo). Contare le cellule all'interno del grande piazzale without quelli che attraversano i bordi.
    5. Calcolare la concentrazione di cellule:
      Numero di cellule / 1000 ml = cellule totali contate × fattore di diluizione × 10 4 (zona del emocitometro).
      Nota: Ad esempio, se il fattore di diluizione è 20 e le cellule totali contate erano 100:
      100 × 20 × 10 4 = 0.1 x 10 7 cellule / 1.000 ml o 1 x 10 6/100 l. Per piastra 0,75 x 10 6 cellule, prendere 75 microlitri fuori delle cellule.
  2. Prendere il numero di cellule necessarie per la placcatura per singolo MEA o capsula di Petri, risospendere le cellule per prevenire l'aggregazione, e li piastra al centro, sulla parte superiore della zona patternate (se necessario, è possibile diluire le cellule nel mezzo) . Per la MEA, una goccia 100 ml nel mezzo. Per vetrino, una goccia di 1000 ml in mezzo.
  3. Incubare le cellule piastrate a 37 ° C per 40 min. Aggiungere mezzo placcatura alle cellule piastrate, fino a 1ml per MEA e 2 ml per vetrino.
  4. Tenere a 37 ° C e, ogni 4 giorni, diluire con mezzo di crescita fresco arricchito con 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 e 0,75% Glutamax.
  5. Dal 6/7 DIV, dopo aver visto i collegamenti tra le isole, diluire media con 10 microlitri / ml FUDR (25 mg + 62,5 mg deossiuridina uridina in 12,5 ml MEM (Minimum Essential Media Aquila)) o qualsiasi altro agente anti-mitotico per evitare gliale crescita eccessiva.

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Risultati

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Un SU8-2075 stampo su un wafer di silicio con uno spessore di circa caratteristica 100 micron è stato utilizzato per modellare i PDMS. Il modello era composta di quadrati di varie dimensioni, con una lunghezza laterale e distanza variabile tra 200 e 700 micron (Figura 1B). La dimensione della piazza stata scelta per adattarsi al campo di vista di un 10X (per isole con una lunghezza laterale <800 micron) e un obiettivo 20X (per isole con una lunghezza laterale <400 micron). Tre parametri, vale a di...

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Discussione

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Un protocollo di crescere reti neuronali modulari 2D in vitro composto da circuiti funzionalmente interconnessi è descritto. La procedura si basa su uno strato adesivo patterning cellulare. Patterning si ottiene con PDMS stencil riproduce la caratteristica negativa della architettura di rete desiderato. Stencil PDMS definiscono le aree in cui lo strato adesivo cellulare è depositato. Una volta che le cellule sono placcati, spontaneamente si riuniscono per le isole ricoperte e di auto-organizzarsi in circuiti in...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal BRIANBOW Progetto Europeo (7PQ Giovani Esploratori, Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jacopo Tessadori per gli utili commenti sul manoscritto, e Silvia Chiappalone per il suo aiuto nel produrre la grafica utilizzata nel video.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PDMS, Sylgard 184Dow Corning
Nalgene camera a vuotoThermo5305-0609
Poli-D-lisina PDLSigmaP7886
Grasso siliconico - SILICAID 1010aidchim LtdH3375
Spin coaterLaurell - Technologies CorporationWS-650-23
Piastra di coltura a 12 pozzettiSigmaCLS3336
5-Fluoro-2'-deossiuridinaSigmaF0503
UridinaSigmaU3003
MEA1060-Inv-BCSistemi
TC02Sistemi
Pen StrepBiological Industries Beit Haemek03-033-1C
B-27Gibco17504044
glutaMAXGibco35050-038
MEM Minimum Essential Medium-EagleBiological Industries Beit Haemek01-025-1B
Micro Electrode Arrays 4QMulti Channel Systems60-4QMEA1000iR-Ti-prManuale di pulizia: http:// www.multichannelsystems.com
wafer di silicioSU8-2075http://www.microchem.com
multicanalemulticanaleProtocollo di preparazione del :

Riferimenti

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