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Articolo metodologico

Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello

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DOI:

10.3791/52657

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13 aprile 2015

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Palo Alto Institute for Research and Education, Veterans Affairs Palo Alto Health Care System, 3Laboratory of Immunology and Vascular Biology, Department of Pathology, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per la valutazione dettagliata dei sottogruppi di leucociti all'interno del microambiente tumorale in un modello tumorale di topo. Le cellule di melanoma B16 che esprimono chemerina sono state impiantate per via sottocutanea in topi singenici. Le cellule del microambiente tumorale sono state quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso, consentendo analisi dettagliate dei sottogruppi di leucociti.

Abstract

Cellule immunitarie specializzate che infiltrano il microambiente tumorale regolano la crescita e la sopravvivenza di neoplasia. Le cellule maligne devono eludere o sovvertire antitumorali risposte immunitarie per sopravvivere e prosperare. Tumori approfittare di una serie di diversi meccanismi di immune "fuga", tra cui l'assunzione di tollerogenico DC, cellule T regolatorie immunosoppressori (Tregs), e le cellule mieloidi soppressori di derivazione (MDSC) che inibiscono le risposte antitumorali citotossici. Al contrario, le cellule immunitarie anti-tumorale effettrici possono rallentare la crescita e l'espansione di tumori maligni: cellule dendritiche immunostimolante, cellule killer naturali che ospitano innata immunità anti-tumorale, e le cellule T citotossiche tutti possono partecipare alla soppressione del tumore. L'equilibrio tra pro e anti-tumorali leucociti determina in ultima analisi, il comportamento e il destino delle cellule trasformate; una moltitudine di studi clinici umani hanno portato questo fuori. Pertanto, l'analisi dettagliata di sottoinsiemi di leucociti all'internomicroambiente tumorale è diventato sempre più importante. Qui, si descrive un metodo per analizzare sottoinsiemi di leucociti infiltranti presenti nel microambiente tumorale in un modello di tumore del mouse. Cellule tumorali di melanoma mouse B16 sono state inoculate sottocute in topi C57BL / 6. In un periodo di tempo specificato, i tumori e la pelle circostante sono stati asportati in blocco e trasformati in sospensioni di cellule singole, che sono stati poi macchiati per il multi-color citometria a flusso. Utilizzando una varietà di marcatori leucociti sottoinsieme, siamo stati in grado di confrontare le relative percentuali di infiltrazione sottoinsiemi di leucociti tra controllo e tumori chemerina esprimono. Gli investigatori possono utilizzare tale strumento per studiare la presenza immunitaria nel microambiente tumorale e quando combinato con le misure tradizionali di dimensioni pinza di crescita tumorale, potenzialmente permetterà loro per chiarire l'impatto dei cambiamenti in composizione immune sulla crescita tumorale. Tale tecnica può essere applicata a qualsiasi modello di tumore in cui il tumore ed il suo microambiente cun essere asportato e trattati.

Introduzione

L'equilibrio tra la crescita del tumore e la promozione e la regressione è, in parte, dipende l'equilibrio del tumore infiltrante leucociti pro- e anti presenti nel microambiente 1,2. Per studiare il microambiente tumorale (TME) e in particolare individuare le sottopopolazioni di leucociti infiltrante, abbiamo sviluppato un metodo per la valutazione dei tumori sottocutanei in un modello murino di tumore. L'importanza di studiare il microambiente tumorale è ben noto e supportato in letteratura. Numerosi studi hanno dimostrato che l'equilibrio delle cellule immunitarie pro e anti-tumorali infiltranti può influire i risultati di crescita del tumore, non solo nel topo, ma anche studi sull'uomo (recensito in 3,4). Ad esempio, Curiel et al. Hanno dimostrato che hanno peggiorato i risultati clinici nei pazienti con tumore ovarico sono stati correlati con la presenza di percentuali crescenti di regolamentazione cellule T CD4 + infiltranti il tumore (Tregs) 5. Il nostro lavoro ha dimostrato l'effetto di un novel leucociti chemiotattico sul rapporto di sottoinsiemi di leucociti in un modello murino di melanoma 6, che anche correlata con diminuita crescita tumorale. Pertanto, le analisi dettagliate dei sottoinsiemi dei leucociti in un tumore è ora più ampiamente riconosciuto e sempre più importante.

Ci sono molti modi per valutare il microambiente tumorale per infiltrazione leucociti; per esempio gruppi hanno ingegnerizzato topi transgenici per esprimere diverse proteine ​​fluorescenti al fine di immagine TME 7, immunoistochimica classica e immunofluorescenza di sezioni conservate 8, comprese varie modalità di imaging quali MRI, PET, la microscopia confocale 9-11 - alcuni con la capacità di monitorare intravitally 10,12. Questi possono essere utilizzati con vari agenti di imaging molecolare, come nanoparticelle 13 o nuovi agenti di contrasto 14 che etichetta cellule immunitarie. Il nostro metodo è un approccio basato citometria di flusso e presenta diversi vantaggi.In primo luogo, l'intero microambiente tumorale può essere campionato; al momento dell'analisi, l'intero tumore sottocutaneo e periferia circostante è chirurgicamente asportati per l'elaborazione. Ciò elimina qualsiasi polarizzazione potenzialmente campionamento all'interno di un singolo tumore e dà un'analisi più "globale" del tumore nel suo complesso. In secondo luogo, noi utilizzando il flusso multicolor citometria di analizzare i sottoinsiemi di leucociti permette di valutare più specificamente il fenotipo dei leucociti infiltranti. A seconda del numero di colori usati, sottoinsiemi molto specifici possono essere identificati. Questo è importante in quanto vi sono diversi sottoinsiemi dei leucociti all'interno di un particolare tipo di cellule - o anche in una classifica generale sottotipo - che hanno funzioni diverse che sono potenzialmente significativo nel determinare il destino del tumore. Ad esempio, le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono stati implicati in antitumorale immunità 15. Tuttavia, il sottoinsieme CCR9 + di pDC ha dimostrato di essere tollerogenico 16, e spostando il balance di tale sottoinsieme può avere un impatto sulla crescita tumorale.

Il nostro metodo è appropriato per sottocutanea o altri tumori che possono essere asportate in blocco. Nelle nostre mani, tumori sono stati uniformemente resecati al momento della eutanasia. Tuttavia, è concepibile, come è stato fatto in alcuni studi, che un tumore sottocutaneo potrebbe essere completamente asportato con chiusura della pelle circostante in una chirurgia di sopravvivenza 17, consentendo così la valutazione ulteriore dell'animale. L'analisi viene quindi eseguita sul tumore resecato. Pertanto, i risultati rappresentano un unico tempo di valutazione nello sviluppo del tumore. Mentre questo permette uno sguardo dettagliato nel microambiente, è anche un'immagine statica di ciò che è senza dubbio un processo dinamico. Tuttavia, leucociti isolati (ad esempio via magnetico separazione o gradiente di densità) possono poi essere analizzati separatamente dal epiteli tumore e stroma, o utilizzati in altri, saggi funzionali per definire ulteriormente la loro fenotipo, come è stato previdentemente descritto 18. Questo metodo, quindi, sarebbe utile per eventuali investigatori interessati a comprendere la composizione dei leucociti all'interno del microambiente tumorale in un dato punto di tempo, sia nella cornice del corso malattia naturale, o dopo uno specifico perturbazione terapeutica. Sebbene non sia fatto da noi, variazioni di questo procedimento potrebbe anche potenzialmente essere utilizzati per analizzare porzioni specifiche di un tumore in isolamento. Ad esempio, date le dimensioni del tumore, la zona periferica (s) può essere scisso dalla centrale, eventualmente nucleo necrotico del tumore per dare il ricercatore una visione più spazialmente segregati del microambiente tumorale.

Nel settore in rapida crescita del tumore immunologia, non ci sarà senza dubbio un numero esponenzialmente crescente di studi che valutano nuovi agenti immunomodulatori in modelli tumorali murini. Diversi studi hanno messo in evidenza le differenze in funzione dei leucociti specifica all'interno del tumore rispetto al periferico enbiente. Ad esempio, Shafer-Weaver et al. Ha dimostrato in un modello murino che CD8 + cellule T antigene-specifica effettrici, mentre attiva in periferia, sono state trasformate in cellule soppressori CD8 + T, una volta vittime della tratta nel microambiente tumorale 19. Questo è stato in parte dovuto al TGFβ, ma altri fattori sono probabilmente coinvolti pure. Pertanto, la valutazione sottoinsiemi leucociti - numeri e rapporti, nonché lo stato funzionale - entro il tumore stesso darà una rappresentazione più accurata degli effetti di un particolare immunomodulazione sul destino tumore.

La nostra tecnica permette un'analisi dettagliata del tumore e fornisce il ricercatore la possibilità di individuare più da vicino i cambiamenti nelle popolazioni di leucociti che approcci precedenti.

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Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità approvato Stanford, Palo Alto VA HCS, e National Institutes of Health istituzionale AnimalCare e uso Comitato le linee guida.

1. Preparazione per Prelievo e Processing (Tempo richiesto: ~ 10-15 min)

  1. Seminare murine cellule B16F0 melanoma (0,5-1 x 10 6) per via sottocutanea o vicino alla linea mediana dell'addome in femminile C57BL / 6 topi come descritto in precedenza 6. In alternativa, inoculare le cellule tumorali in altri siti anatomici (es fianco, pad grasso mammario, etc).
    NOTA: Qualsiasi numero di tumori (impiantato o spontaneo) può essere utilizzato e valutato utilizzando questo protocollo. Ad esempio, altro comunemente usato tumori singenici in C57BL / 6 includono la linea colon MC38, Lewis carcinoma polmonare (LLC), e la linea prostata TRAMP-C2. Mentre xenotrapianti umani in topi immunodeficienti inoculate possono essere valutati in questo modo, va osservato che la profiles dei leucociti infiltranti il ​​tumore necessariamente essere modificati in conformità con lo stato immunodeficienti del mouse ospitante.
    1. Utilizzare supporti completo (ad esempio RPMI contenente 10% FBS e additivi) o un altro tampone contenente proteine ​​appropriata (ad es HBSS o PBS + 1% FBS o 1% BCS). Raffreddare i media o tampone a 4 ° C prima euthanization.
  2. Impostare tubi di raccolta e filtri per i tumori asportati; mettere questi su ghiaccio.
    1. Utilizzare un tubo da 50 ml conica per tumore sia asportato. Inserire un filtro sospensione di cellule 40-70 micron di ciascuno. In alternativa, utilizzare 15 ml provette coniche con filtro a rete metallica. Utilizzare 5 ml stantuffo della siringa o una penna di spessore per creare un filtro a tazza in cima al tubo 15 ml.
  3. Preparare strumenti per la resezione del tumore e di trasformazione; Utilizzare pinze chirurgiche e forbici sottili per resecare e tumori di processo. Utilizzare 70% di etanolo per pulire gli strumenti tra i campioni resezioni / tumorali. Per numero maggiore ocampioni F (ad esempio> 10), si consiglia l'elaborazione simultanea di campioni da parte di più ricercatori per evitare differenze significative nel tempo di elaborazione tra i campioni tumorali.

2. Tumore resezione (Tempo richiesto: ~ 5 min / tumorale)

  1. Euthanize B16 tumore topo, utilizzando singolarmente biossido di carbonio o altro metodo approvato.
  2. Fissare il mouse su un palco chirurgica. Spruzzare la zona tumorale con il 70% di etanolo e pulire in eccesso; questo aiuta a prevenire la diffusione di tutti i capelli presenti. Per i topi non-nudo, radere l'area pelle intorno al tumore prima della resezione, se necessario.
  3. Utilizzando pinze e forbici, resecare il tumore sottocutaneo in blocco, compreso sovrastante e la pelle circostante. La quantità di "margine" pelle presa può variare, ma in genere resecare 2-3 mm della pelle intorno al tumore.
    1. Pesare tumori resezione (+/- cute circostante), a questo punto. Posizionare la sezione pelle / tumore asportato nel filtro fissato all'interno del pltubo conico astic.

3. Preparare una sospensione Tumor singola cella (Tempo richiesto: ~ 5-7 min / tumorale)

  1. Utilizzare pinze e forbici per tritare tumore e sovrastante / pelle circostante. Tritare il campione con le forbici fino a quando tutte le grandi sezioni di tessuto vengono trasformati in sezioni 1-2 mm.
    NOTA: in genere, i tumori interi vengono elaborati; In alternativa, per i tumori di maggiori dimensioni, sezioni rappresentative dei tumori possono essere tritati e trattati.
  2. Utilizzando un pistone da una siringa monouso 5 o 10 ml, disaggregare meccanicamente il tessuto tumorale tritata contro il filtro garantito.
  3. Utilizzando una pipetta, lavare il tessuto tumorale trattati con 5-10 ml di mezzi freddo o buffer. Questo filo singole cellule attraverso il filtro.
  4. Ripetere i due passaggi precedenti più volte, assicurando che il numero totale e volumi di lavaggi sono circa gli stessi per i tumori di dimensioni simili.
    1. Dopo aver lavato il tessuto tumorale elaborato, osservarepiccoli frammenti di pelle e / o di altri tessuti connettivi devono essere lasciati nel filtro.
    2. In alternativa, per i tumori in cui solo disaggregazione meccanica può non essere sufficiente, la digestione con collagenasi e / o altri enzimi può essere eseguita prima della procedura di macinazione. Ciò consentirà una sospensione più approfondita singola cellula. Tuttavia, va notato che tali protocolli di digestione possono influenzare l'espressione dell'antigene di superficie 20, quindi si deve usare cautela nell'interpretazione di questi risultati.
  5. Lavare e agglomerare le cellule aggiungendo media / tampone e centrifugazione a 4 ° C 500 g per 5 min.

4. FACS colorazione di sospensione singola cella (Tempo richiesto: ~ 30-60 min)

  1. Risospendere le cellule in tampone FACS ghiaccio freddo (PBS + 1% FBS).
  2. Contare cellule vitali con trypan blu e un emocitometro o contatore di cellule automatizzati.
  3. Determinare la resa di cellule vitali totale per volume. Questi dati possono essere utilizzati per estrapolarenumero assoluto di tumore leucociti infiltranti in combinazione con dati FACS.
  4. Determinare il numero di celle da colorare e analizzato mediante FACS. Questo sarà influenzato da diversi fattori (ad esempio tumore tipo istologico, età e dimensione del tumore, percentuale media di leucociti infiltranti, etc.).
    NOTA: In B16 melanoma, abbiamo trovato una bassa percentuale di tumori infiltranti leucociti (TIL, in genere <5%) rispetto alle cellule tumorali. Così, almeno 1 x 10 6 tumore totale (tumori + leucociti infiltranti) le cellule sono state in genere raccolti via FACS per l'analisi.
    1. Utilizzando i dati di conteggio Trypan-macchiato, volume calcolato di cellule da colorare per FACS. Ad esempio, se TIL tipicamente costituiscono 5% delle cellule tumorali totali (molte delle cellule tumorali sarà morto macchia trypan), fattore questo nel numero totale di tumore sospensione singola cella da colorare.
    2. Per sottoinsiemi di leucociti meno comuni esempio CCR9 + pDC) utilizzare un numero maggiore di cellule tumorali totali (ad esempio 2-3 x 10 6) per FACS colorazione, data la bassa frequenza relativa di queste cellule in sospensione di cellule singole.
  5. Colorare la sospensione singola cellula tumorale per FACS.
    1. Per discriminazione live / morto, utilizzare una macchia risolvibile o macchia non risolvibile (ad esempio ioduro di propidio) può essere utilizzato. Se cellulare sono macchiati senza discriminazioni live / morti, cautela deve essere informato dato il potenziale di legame non specifico degli anticorpi.
    2. Colorare la sospensione cellulare per specifici sottoinsiemi di leucociti utilizzando un protocollo di colorazione FACS standard. Cellule blocchi per ridurre vincolante con PBS / FBS contenente siero di ratto 1% e Fc block (anti-CD16 / 32) per 10 min prima della colorazione con anticorpi antigene-specifici anticorpi non specifico. Includere gli anticorpi giusti controllo isotipo per assicurare la colorazione è specifica.
    3. A questo punto, dopo la colorazione FACS è completa, fissare campioni con 4% di formaldeide o altro agente fissativo simile. Conservare i campioni a 4 ° C in dark (da evitare quenching di fluorofori) fino al momento della raccolta e l'analisi.
      NOTA: Memorizzazione campioni fissati per lunghi periodi di tempo può provocare l'alterazione del segnale e l'intensità dei fluorofori 21.
    4. Raccogliere i campioni su un citometro di flusso. Flusso ottimale citometro impostazioni variano a seconda del tipo di strumento e impostazione laser / rivelatore.
      NOTA: Inoltre, ci può essere la variabilità tra esperimenti, anche se si utilizza la stessa macchina. Quindi, eseguire appropriata configurazione della macchina (ad esempio utilizzando perline di calibrazione) per garantire un'adeguata impostazione della compensazione prima della raccolta e l'analisi di ogni esperimento FACS.
  6. Analisi di sottoinsiemi leukoctye
    1. Utilizzando il software di analisi dei dati FACS, per analizzare i dati. Per un live macchia / morto, iniziare gating fuori le cellule morte. Usare anticorpi contro un marcatore specifico dei leucociti (ad esempio anti-CD45) per identificare leucociti all'interno delle cellule vive.
      1. Dopo questa operazione, utilizzare vari Gatiregimi ng per identificare sottoinsiemi specifici, a seconda del protocollo di colorazione. Ad esempio, per identificare le cellule CD4 + T, selezionare la regione SSC lo dalla popolazione CD45 + e selezionare le cellule CD19 +-CD3; da queste cellule CD4 + T può essere identificato 22.
    2. Analizzare i dati e presentarli in un certo numero di modi diversi per garantire la coerenza e identificare i modelli o le tendenze (ad esempio utilizzare un totale di numeri, percentuali o rapporti di quantificare sottoinsiemi).
      NOTA: Per esempio, abbiamo guardato totale CD45 + cellule dal vivo come percentuale di cellule tumorali totali raccolti (Figura 1). Inoltre, abbiamo quindi calcolato la percentuale di ciascun sottogruppo di leucociti (ad esempio, le cellule CD4 + T) all'interno del tumore e confrontato questi come i rapporti tra il controllo e gruppi di test (Figura 3).

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Risultati

I nostri risultati hanno dimostrato che forzata over-espressione di chemerina nei tumori B16 murini augmented la percentuale di tumori infiltranti leucociti (TILS). Inoltre, sono stati identificati modifiche al rapporto relativo di sottoinsiemi di leucociti rappresentate nel microambiente tumorale associato con espressione chemerina. Re-stampa con il permesso di Pachynski et al. 6.

La Figura 1 mostra che c'è stato un significativo aumento totale CD45 + ...

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Discussione

Esecuzione di analisi dettagliata del microambiente tumorale è fondamentale nel determinare i meccanismi e gli effetti di immunomodulazione. Con la crescente presenza di immunotherapeutics nel regno clinico umano, comprendere l'impatto di questi agenti sui leucociti infiltranti il ​​tumore sta diventando necessaria per definire il loro meccanismo d'azione. Negli esseri umani, esistono spesso difficoltà cliniche e / o logistiche nell'ottenere e analizzando tessuto tumorale per l'analisi dei leucociti sott...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01-CA169354   e R01-047822   dal National Institutes of Health e un Merit Award dal Department of Veterans Affairs (BCE). RKP è stato sostenuto da NIH T32 CA009287-30A1, un ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Fellowship progetto, e un American Cancer Society Mentored Research Scholar di Grant; BAZ è stato sostenuto da NIH concedere AI079320. JM è stato sostenuto da borse di NIH T-32 borsa di formazione T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 e American Cancer Society borsa di studio post-dottorato PF-12-052-01-CSM.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMICellgro10-040http://cellgro.com; tenere sul ghiaccio
FBSCellgro35-011-CVhttp://cellgro.com
50 ml tubi coniciFalcon14-432-22fischersci.com
40 μ m filterFalcon08-771-1
fischersci.com siringa da 5 mlBD14-823-35fischersci.com
forbici/pinze chirurgicheRobozRS-5910roboz.com
PBSCellgroMT-21-030-CMhttp://cellgro.com; tenere sul ghiaccio
tripano bluCellgroMT-25-900-CIfischersci.com
ecitometroHausser Scientifice 02-671-54 fischersci.com
Macchia viva/mortaLife TechnologiesL34957lieftechnologies.com
software FlowJoTreeStar, Incflowjo.com

Riferimenti

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