Questo protocollo descrive un metodo per la valutazione dettagliata dei sottogruppi di leucociti all'interno del microambiente tumorale in un modello tumorale di topo. Le cellule di melanoma B16 che esprimono chemerina sono state impiantate per via sottocutanea in topi singenici. Le cellule del microambiente tumorale sono state quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso, consentendo analisi dettagliate dei sottogruppi di leucociti.
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Articolo metodologico
Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule immunitarie specializzate che infiltrano il microambiente tumorale regolano la crescita e la sopravvivenza di neoplasia. Le cellule maligne devono eludere o sovvertire antitumorali risposte immunitarie per sopravvivere e prosperare. Tumori approfittare di una serie di diversi meccanismi di immune "fuga", tra cui l'assunzione di tollerogenico DC, cellule T regolatorie immunosoppressori (Tregs), e le cellule mieloidi soppressori di derivazione (MDSC) che inibiscono le risposte antitumorali citotossici. Al contrario, le cellule immunitarie anti-tumorale effettrici possono rallentare la crescita e l'espansione di tumori maligni: cellule dendritiche immunostimolante, cellule killer naturali che ospitano innata immunità anti-tumorale, e le cellule T citotossiche tutti possono partecipare alla soppressione del tumore. L'equilibrio tra pro e anti-tumorali leucociti determina in ultima analisi, il comportamento e il destino delle cellule trasformate; una moltitudine di studi clinici umani hanno portato questo fuori. Pertanto, l'analisi dettagliata di sottoinsiemi di leucociti all'internomicroambiente tumorale è diventato sempre più importante. Qui, si descrive un metodo per analizzare sottoinsiemi di leucociti infiltranti presenti nel microambiente tumorale in un modello di tumore del mouse. Cellule tumorali di melanoma mouse B16 sono state inoculate sottocute in topi C57BL / 6. In un periodo di tempo specificato, i tumori e la pelle circostante sono stati asportati in blocco e trasformati in sospensioni di cellule singole, che sono stati poi macchiati per il multi-color citometria a flusso. Utilizzando una varietà di marcatori leucociti sottoinsieme, siamo stati in grado di confrontare le relative percentuali di infiltrazione sottoinsiemi di leucociti tra controllo e tumori chemerina esprimono. Gli investigatori possono utilizzare tale strumento per studiare la presenza immunitaria nel microambiente tumorale e quando combinato con le misure tradizionali di dimensioni pinza di crescita tumorale, potenzialmente permetterà loro per chiarire l'impatto dei cambiamenti in composizione immune sulla crescita tumorale. Tale tecnica può essere applicata a qualsiasi modello di tumore in cui il tumore ed il suo microambiente cun essere asportato e trattati.
Introduzione
L'equilibrio tra la crescita del tumore e la promozione e la regressione è, in parte, dipende l'equilibrio del tumore infiltrante leucociti pro- e anti presenti nel microambiente 1,2. Per studiare il microambiente tumorale (TME) e in particolare individuare le sottopopolazioni di leucociti infiltrante, abbiamo sviluppato un metodo per la valutazione dei tumori sottocutanei in un modello murino di tumore. L'importanza di studiare il microambiente tumorale è ben noto e supportato in letteratura. Numerosi studi hanno dimostrato che l'equilibrio delle cellule immunitarie pro e anti-tumorali infiltranti può influire i risultati di crescita del t....
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Protocollo
NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità approvato Stanford, Palo Alto VA HCS, e National Institutes of Health istituzionale AnimalCare e uso Comitato le linee guida.
1. Preparazione per Prelievo e Processing (Tempo richiesto: ~ 10-15 min)
- Seminare murine cellule B16F0 melanoma (0,5-1 x 10 6) per via sottocutanea o vicino alla linea mediana dell'addome in femminile C57BL / 6 topi come descritto in precedenza 6. In alternativa, inoculare le cellule tumorali in altri siti anatomici (es fianco, pad grasso mammario, etc).
NOTA: Qualsiasi numero di tumori (im....
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Risultati
I nostri risultati hanno dimostrato che forzata over-espressione di chemerina nei tumori B16 murini augmented la percentuale di tumori infiltranti leucociti (TILS). Inoltre, sono stati identificati modifiche al rapporto relativo di sottoinsiemi di leucociti rappresentate nel microambiente tumorale associato con espressione chemerina. Re-stampa con il permesso di Pachynski et al. 6.
La Figura 1 mostra che c'è stato un significativo aumento totale CD45 + .......
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Discussione
Esecuzione di analisi dettagliata del microambiente tumorale è fondamentale nel determinare i meccanismi e gli effetti di immunomodulazione. Con la crescente presenza di immunotherapeutics nel regno clinico umano, comprendere l'impatto di questi agenti sui leucociti infiltranti il tumore sta diventando necessaria per definire il loro meccanismo d'azione. Negli esseri umani, esistono spesso difficoltà cliniche e / o logistiche nell'ottenere e analizzando tessuto tumorale per l'analisi dei leucociti sott.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01-CA169354 e R01-047822 dal National Institutes of Health e un Merit Award dal Department of Veterans Affairs (BCE). RKP è stato sostenuto da NIH T32 CA009287-30A1, un ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Fellowship progetto, e un American Cancer Society Mentored Research Scholar di Grant; BAZ è stato sostenuto da NIH conced....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; tenere sul ghiaccio |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml tubi conici | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μ m filter | Falcon | 08-771-1 | |
| fischersci.com siringa da 5 ml | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| forbici/pinze chirurgiche | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; tenere sul ghiaccio |
| tripano blu | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| ecitometro | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Macchia viva/morta | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| software FlowJo | TreeStar, Inc | flowjo.com |
Riferimenti
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunos....
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