I test di mammosfera fluttuante possono studiare il sottogruppo di cellule di cancro al seno staminali che sopravvivono in condizioni di sospensione e mostrano una tumorigenesi migliorata quando impiantate nei topi. Questo protocollo fornisce una comoda misura in vitro della capacità di formare sfere, un proxy per la tumorigenesi in vivo, facilitando al contempo l'analisi del panorama trascrizionale associato allo stelo.
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Articolo metodologico
Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Simile ai tessuti sani, molti di sangue e tumori solidi sono ora pensato di essere organizzati gerarchicamente, con un sottoinsieme di cellule tumorali staminali, come quello auto-rinnovarsi dando origine a una progenie più differenziato. La comprensione e il targeting queste cellule staminali tumorali nel cancro al seno, che può possedere una maggiore chemio e radio-resistenza rispetto alla massa tumorale non-staminali, è diventato un importante settore di ricerca. Marcatori compreso CD44, CD24, e l'attività ALDH possono essere valutati utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) per isolare in modo prospettico le cellule che mostrano una maggiore tumorigenicità quando impiantati in topi immunocompromessi: il saggio mammosphere è diventato anche ampiamente utilizzato per la sua capacità di identificare in modo retrospettivo Sfera d' formando cellule che si sviluppano da cloni di cellule simil-staminali singolo. Qui descriviamo approcci per la coltura appropriato di mammospheres da linee cellulari o campioni elementari di pazienti, la loro passaging, e calcoli per stimare sfera fefficienza orming (SFE). Prima discutiamo considerazioni chiave e le insidie della pianificazione e l'interpretazione degli esperimenti mammosphere appropriata.
Introduzione
L'esistenza di linee cellulari tumorali guidati da cellule staminali tumorali staminali come ha notevolmente aggiunto alla nostra comprensione del tumore eterogeneità. Mentre alcuni diversità fenotipica nei tumori si pone dalla conseguenza clonale di cloni geneticamente distinte, una componente importante sembra essere il risultato di differenze epigenetiche: le cellule tumorali possono passare (a volte in modo reversibile) tra stelo, progenitore, e gli stati differenziati attraverso l'attivazione o la repressione di specifici geni programmi di espressione 1 - 3. Questo può riflettere cellulari fattori intrinseci o estrinseci, riflettendo il programma genica attualmente espressa in una cella con la sua conseguente Autocrino in combinazione con segnalazione paracrina dalla vicina cancro stromale o cellule immunitarie consegna fattori modulatori e condizioni microambientali quali il grado di ipossia 2,4,5.
Anche se gli approcci innovativi lineage tracingstanno avanzando la nostra capacità di studiare le cellule staminali del cancro putativi in loro in vivo nicchia 6-8, saggi-sfera formando rimangono un approccio popolare e conveniente per stimare il potenziale delle cellule del cancro al seno 'a comportarsi come cellule staminali, almeno nelle condizioni di analisi utilizzati. E 'spesso usato insieme a metodi retrospettivi per le cellule staminali del cancro purificante, per la loro espressione di marcatori di membrana CD44 e CD24 9, e livelli di attività dell'enzima ALDH (aldeide deidrogenasi) 10, marcatori che sono state proposte per corrispondere a più mesenchymal- e epiteliale cellule staminali del cancro -come rispettivamente 11. L'approccio di formazione sfera è stato sviluppato come il saggio neurosfere, permettendo la crescita delle cellule staminali putative da singoli cloni non aderenti, condizioni privo di siero con l'aggiunta di fattore di crescita epiteliale (EGF) 12, dopo essere utilmente applicato alla normalità e cancerose tessuti del seno.
L'identità della cellula fondatore sfera formatura, ei tipi di cellule miste che compongono la massa sfera, sono rilevanti per le inferenze che possono essere fatte da mammo- o altra sfera formando saggi. Osso quiescente cellule staminali in buona lungo termine, pensato per riposare in fase G0, non sperimenteranno la precisa combinazione di fattori che potrebbero favorire l'attivazione in vivo. Il saggio mammosphere consente invece la crescita delle cellule sia pronta per divisione mitotica o già divisione 13. Questi progenitori, pur non essendo un cellulare veramente riposo, possono essere il palcoscenico delle cellule che prolifera con i mitogeni FEG e il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) utilizzati nel test. Tuttavia, contengono una serie di segnalazione cellulare associata staminali attivato Percorsi di 14. Inoltre, il tasso della loro formazione riguarda la tumorigenicità del tessuto sono stati prelevati da, misurata dalla loro potenza in saggi di diluizione limitate eterotrapianti topo 2,15,16 </ Sup>.
Qui forniamo protocolli dettagliati per isolare singole cellule e generare mammospheres primari da entrambe le linee di cellule di cancro al seno umano e campioni clinici di tumori al seno. Abbiamo anche descrivono come eseguire passaggi seriali di mammospheres primari per valutare auto-rinnovamento, e come calcolare sfera formando efficienza che consente il confronto tra diverse densità di semina (vedi schema in figura 1).
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Protocollo
Le procedure di seguito sono stati eticamente approvati dal Imperial College di Londra.
1. Generazione di mammospheres primarie di Human Breast Cancer Cell Lines
NOTA: eseguire le seguenti operazioni sotto una cappa cultura sterile.
- Preparare Mammosphere media contenente DMEM / F12 integrato con 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 U / ml di streptomicina. Preparare completo supporto al momento dell'uso con l'aggiunta di 20 ng ml ricombinante fattore / di crescita epidermico umano (EGF, Sigma), 10 ng / ml ricombinante di base del fattore di crescita dei fibroblasti umani (bFGF; Sistemi di R & S) e 1x B27 supplemento.
- Aspirare mezzi di pallone contenente aderenti MCF-7 o MDA-MB-231 cellule (o una linea cellulare di cancro al seno di tua scelta; 70-80% confluenza), lavare due volte in 1x PBS, e trypsinize cellule.
- Cellule centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Surnatante e risospendere le cellule decantare in 1-5 ml di mezzi mammosphere. Pipettasu e giù e se necessario utilizzare un filtro tappo filtro cella 40 micron per ottenere cella singola sospensione. Utilizzare un emocitometro per garantire una sospensione singola cella è formata (se non, utilizzare un ago G 25 alla siringa sospensione cellulare fino a 3 volte).
- Se necessario isolare CD44 + CD24- sottoinsieme cellulare tramite FACS con anti-CD24-ficoeritrina (PE) e isotiocianato (FITC) anticorpi monoclonali anti-CD44 9-fluoresceina. In alternativa, isolare tale popolazione utilizzando una cella magnetica attivato l'ordinamento del sistema (MACS) con anti-CD44 e anti-CD24-biotina microsfere combinati come da istruzioni del produttore. Eseguire selezione positiva utilizzando LS colonne, e selezione negativa utilizzando colonne LD e confermare i fenotipi di tutte le cellule isolate mediante citometria di flusso 17.
- Calcolare il numero di cellule vitali per ml utilizzando trypan blue.
NOTA: La vitalità cellulare è calcolato come il numero di cellule vitali diviso per il numero totale di celle all'interno delle griglie sul hemocyTometer. Le cellule che occupano blu trypan sono considerate non vitali. La seguente procedura viene utilizzata per determinare con precisione percentuale di cellule vitali.- Preparare una soluzione allo 0,4% di blu trypan in PBS. Aggiungere 0,1 ml di trypan blu stock soluzione a 1 ml di cellule. Caricare un emocitometro ed esaminare immediatamente al microscopio a basso ingrandimento. Contare il numero di cellule totali e il numero di cellule colorazione blu.
Cellule vitali = [1.00 - (Numero di celle blu ÷ Numero di cellule totali)] × 100. - Per calcolare il numero di cellule vitali per ml di cultura, utilizzare la formula seguente. Ricordare di correggere il fattore di diluizione.
Numero di cellule vitali × 10 4 × 1,1 = cellule / ml cultura
- Preparare una soluzione allo 0,4% di blu trypan in PBS. Aggiungere 0,1 ml di trypan blu stock soluzione a 1 ml di cellule. Caricare un emocitometro ed esaminare immediatamente al microscopio a basso ingrandimento. Contare il numero di cellule totali e il numero di cellule colorazione blu.
- Risospendere una quantità predeterminata di cellule in 2 ml di mezzi completi mammosphere in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti aderente ultra-bassa. La densità di semina è normalmente 500-4,000 cellule / cm 2 cellule per pozzetto. Uso Opzionalmente loattacco w piastre da 24 pozzetti, mentre la semina di cellule alla stessa densità in 0,5 ml di media.
NOTA: si consiglia l'ottimizzazione di densità di semina e il tempo della cultura per ogni linee cellulari di interesse. - Incubare bassa fissaggio 6 pozzetti ultra a 37 ° C e 5% CO 2 per 5-10 giorni (a seconda della linea cellulare e le dimensioni mammospheres) senza disturbare le piastre, in particolare durante la fase di crescita dei primi 5 giorni .
2. Generazione di mammospheres primarie di cancro al seno umano campioni clinici
NOTA: tessuto del cancro del seno umano può essere ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia per la rimozione di tumori al seno. Tessuto Store sul ghiaccio per un massimo di 24 ore in 50 ml provette sterili in coltura contenente 100 U / ml di penicillina e 100 U / ml di streptomicina. Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa cultura sterile.
- Trasferire il campione in un piatto Petri tessuto 100 mm con un piccolo volume di media. Remove il tessuto adiposo con le forbici sterili, scapel e pinzette.
- Aggiungere 2-3 ml di DMEM / F12 e tritare il campione in 1 mm 3 pezzi con scapel sterile o lama di rasoio fino a quando rimangono senza grandi pezzi.
- Risospendere le parti di tessuto a pre-riscaldato a 10 ml di DMEM contenente enzimi proteolitici (3.000 U / ml di collagenasi e 1000 U / ml ialuronidasi) e incubare a 37 ° C in un agitatore rotativo fino a che tutti i frammenti di tessuto vengono digeriti. Di solito la digestione completa richiede 1-3 ore. Regolare il tempo di digestione secondo caratteri patologici di tumori. (Per esempio adenocarcinoma mammario è generalmente difficile da digerire rispetto al carcinoma mucinoso che è più fragile e richiede tempi più rapidi). Valutare il grado di digestione ogni ora ½ osservando 20 microlitri di sospensione sotto emocitometro.
- Lasciare i frammenti a sedimentare per 5 minuti, poi trasferire il surnatante in una provetta di polipropilene da 15 ml conica e centrifugare a 200 xg per 10 min a temtemperatura. Decantare con cautela le cellule surnatante e risospendere in 1 - 5 ml di media mammosphere.
- Seguire i passaggi 1,1-1,4 sopra descritte per linee cellulari per ottenere e piastra di sospensioni di cellule singole. Passano cellule attraverso il 25 G siringa un massimo di 2 volte, se necessario, per limitare le cellule dannose.
3. Mammosphere Forming Efficiency (%) Calcolo
- Dopo il periodo di coltura, contare le mammospheres (maggiori di 40 micron di diametro) con un microscopio a 40X di ingrandimento. Immagine 5 campi aleatori utilizzando una fotocamera digitale su un microscopio ottico e determinano la dimensione mammospheres utilizzando il software di acquisizione. Utilizzare qualsiasi immagine software di analisi.
- Calcola Mammosphere Efficienza Forming (MFE%) mediante la seguente equazione:
MFE (%) = (° mammospheres per pozzetto) / (° cellule seminate per pozzetto) x 100
4. Passaging serie di mammospheres per la valutazione di Self-rinnovamento
- Pipetta i supporti contenenti il mammospheres di ogni bene in un tubo da 15 ml. Lavare i pozzetti con PBS e aggiungere ai media raccolti. Centrifugare a 115 xg per 10 min a temperatura ambiente.
- Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di pre-riscaldato 0,5% tripsina / 0,2% EDTA. Incubare per 2-3 min.
- Aggiungere 500 ml di FCS per neutralizzare tripsina. Centrifugare a 500 g per 5 min. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 100 ml di mammospheres media, pipettando su e giù per disaggregare sfere.
- Contare le cellule con emocitometro e determinare se le cellule sono in sospensione di cellule singole. Se non passare attraverso un 25 G siringa fino a 3 volte per ottenere cellule singole. Seme le cellule in un nuovo minimo attaccamento 6 pozzetti ultra alla stessa densità utilizzata nella generazione primaria.
- Dopo 5-10 giorni, contare sfere> 40 micron e calcolare l'efficienza sfera che forma con la formula riportata prima.
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Risultati
Diversi campioni o quelli sottoposti a trattamenti diversi possono variare nel numero di mammospheres> 40 micron che formano dopo normalizzazione per celle iniziali seminate. Calcola mammosphere formando efficienza (MFE) per ogni trattamento cresciuto in triplice copia. Ciò consente esperimenti con diverse densità di semina da confrontare. I dati sono migliori visualizzata su un grafico a barre, idealmente con controlli positivi e negativi, e la visualizzazione della deviazione standard di tutti i pozzetti in triplic...
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Discussione
La valutazione di successo di mammospheres primarie e secondarie si basa su cellule in fase placcato in sufficientemente basse densità che mammospheres forma da singoli cloni, con un minimo di aggregazione sfera. Tuttavia a densità che sono troppo bassi, troppo pochi mammospheres possono formare per distinguere gli effetti dei trattamenti statisticamente. Densità di semina deve essere ottimizzata per ciascuna linea cellulare utilizzata dal momento che possono variare notevolmente in loro efficienza sfera formando (color...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi che possa essere percepito come pregiudizievole per l'imparzialità di questo articolo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dal BRC Imperiale, l'Istituto Nazionale per la Ricerca Sanitaria, e lotta contro il cancro, con menzione speciale per Craft Hilary e Sir Douglas Myers.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutammina | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillina & Streptomicina | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Fattore di crescita dei fibroblasti basici umani ricombinanti (bFGF) | R& D systems | 233-FB-025 | |
| 1x integratore di B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0,5% tripsina/0,2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Siero fetale di vitello | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Piastre a 6 pozzetti a basso attacco | Corning | CLS3814 | |
| Collagenasi tipo 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Ialuronidasi | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Lamette da barba sterili | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Bisturi sterile | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Microdissezione sterile forbici | Sigma Aldrich | S3146 |
Riferimenti
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