Qui, documentiamo l'uso del saggio di formazione di colonie di agar morbido per testare gli effetti di un inibitore dell'enzima peptidilarginina deiminasi (PADI), BB-Cl-ammidina, sulla tumorigenicità del cancro al seno in vitro.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario
In questo articolo
Sommario
Abstract
Date le difficoltà intrinseche nello studio dei meccanismi di progressione tumorale in vivo, i saggi basati su cellule come il saggio di formazione di colonie di agar soft (d'ora in poi chiamato saggio di agar morbido), che misura la capacità delle cellule di proliferare in matrici semisolide, rimangono un segno distintivo della ricerca sul cancro. Un vantaggio chiave di questa tecnica rispetto ai tradizionali saggi di coltura cellulare 2D monostrato o 3D di sferoidi è la stretta imitazione dell'ambiente cellulare 3D con quello osservato in vivo. È importante sottolineare che il saggio di soft agar fornisce anche uno strumento ideale per testare rigorosamente gli effetti di nuovi composti o condizioni di trattamento sulla proliferazione e la migrazione cellulare. Inoltre, questo test consente la valutazione quantitativa del potenziale di trasformazione cellulare nel contesto delle perturbazioni genetiche. Recentemente abbiamo identificato la peptidilarginina deiminasi 2 (PADI2) come potenziale biomarcatore del cancro al seno e bersaglio terapeutico. Qui evidenziamo l'utilità del test soft agar per gli studi preclinici antitumorali testando gli effetti dell'inibitore PADI, BB-Cl-amidina (BB-CLA), sulla tumorigenicità delle cellule di carcinoma duttale umano in situ (MCF10DCIS).
Introduzione
Sia le cellule non trasformate (normali) che quelle trasformate possono facilmente proliferare in una coltura monostrato 2D. Questa forma di crescita cellulare aderente è molto dissimile da quella che avviene in vivo dove, in assenza di stimolazione mitogenica, le cellule spesso non si dividono rapidamente all'interno del loro microambiente. Il saggio di agar morbido, d'altra parte, si distingue dai sistemi di coltura 2D perché quantifica la tumorigenicità misurando la capacità di una cellula di proliferare e formare colonie in sospensione all'interno di un gel di agarosio semisolido1. In questo contesto, le cellule non trasformate non sono in grad....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione del 3% 2-idrossietile Agarose
- In un secco bottiglia di vetro pulito, 100 ml, aggiungere 0,9 g di 2-idrossietile agarosio (Agarose VII) seguiti da 30 ml di acqua distillata.
- Forno a microonde la miscela per 15 secondi e delicatamente agitare. Ripetere questa operazione almeno altre tre volte fino a quando la polvere si dissolve completamente agarosio.
- Autoclave la bottiglia soluzione contenente per 15 min.
- Lasciare che la soluzione di agarosio raffreddare a RT prima di un ulteriore utilizzo. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
2. Preparazione dello strato inferiore: 0....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'agar morbido dosaggio formazione di colonie può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni documentano la tumorigenicità delle cellule tumorali. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che la matrice semisolida favorisce selettivamente la crescita di cellule che possono proliferare in modo ancoraggio-indipendente. Questa caratteristica è esposto principalmente dalle cellule tumorali, ma non dalle cellule normali. Usiamo soprattutto questa tecnica per testare l'efficacia di inibizione della c.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il tasso di formazione di colonie in agar morbido varia a seconda del tipo di cellula 9. Pertanto, il numero di cellule per cominciare dovrebbe essere ottimizzato e regolato di conseguenza. Un intervallo di partenza consigliato è tra i 5 x 02-01 OTTOBRE x 10 4 cellule per bene con un 6-pozzetti. Inoltre, le dimensioni delle colonie varia a seconda del tasso di crescita di ogni cella. Pertanto, è necessario un predefinito un cut-off per dimensioni delle colonie di annotare colonie individ.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati al Dr. Richard Cerione, al Dr. Marc Antonyak, e a Kelly Sullivan, della Cornell University, per averci fornito consigli tecnici, e alla Dr. Gerlinde Van de Walle, della Cornell University, per aver condiviso il loro microscopio invertito Olympus CKX41.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopia | 1021859251 | |
| Microscopio Invertito | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Siero equino | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillina Streptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-idrossietilagarosio: Tipo VII, bassa temperatura di gelificazione | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
Riferimenti
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A.....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
