La funzione delle cellule vascolari dipende dall'attività dei messaggeri intracellulari. Qui descritto è un metodo di imaging ex vivo a due fotoni che consente la misurazione dei livelli intracellulari di calcio e ossido nitrico in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici in singole cellule endoteliali e muscolari lisce di un'aorta isolata.
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Articolo metodologico
A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il calcio è un regolatore molto importante di molti processi fisiologici nei tessuti vascolari. La maggior parte delle funzioni endoteliali e muscolari lisce altamente dipendono dalle variazioni dei calcio intracellulare ([Ca 2+] i) e l'ossido nitrico (NO). Al fine di comprendere come [Ca 2 +] i, NO e molecole a valle sono gestite da un vaso sanguigno in risposta a vasocostrittori e vasodilatatori, abbiamo sviluppato una nuova tecnica che si applica calcio etichettatura (o NO-etichettatura) coloranti con due fotoni microscopia per misurare la movimentazione di calcio (o la produzione di NO) nei vasi sanguigni isolati. Descritto qui è una procedura dettagliata passo-passo che illustra come isolare un dell'aorta da un topo, etichetta di calcio o di NO nelle cellule endoteliali o muscolari lisce, e l'immagine del calcio transienti (o la produzione di NO) utilizzando un microscopio a due fotoni seguente fisiologico o stimoli farmacologici. I vantaggi di utilizzare il metodo sono multi-fold: 1) è possibile simultanealy misurare transienti di calcio in entrambe le cellule endoteliali e cellule muscolari lisce in risposta a stimoli diversi; 2) che permette di cellule un'immagine endoteliali e cellule muscolari lisce nel loro ambiente nativo; 3) questo metodo è molto sensibile al calcio intracellulare o nessuna modifica e genera immagini ad alta risoluzione per misurazioni precise; e 4) approccio descritto può essere applicato alla misura di altre molecole, quali le specie reattive dell'ossigeno. In sintesi, l'applicazione della microscopia a due fotoni emissione laser per monitorare transienti di calcio e la produzione di NO nelle endoteliali e muscolari lisce cellule di un vaso sanguigno isolato ha fornito dati quantitativi di alta qualità e promuovere la nostra comprensione dei meccanismi che regolano la funzione vascolare.
Introduzione
Il calcio è un secondo messaggero fondamentale all'interno delle cellule vascolari quali cellule endoteliali e muscolari lisce. È lo stimolo primario per la contrazione vascolare e svolge un ruolo importante nella dilatazione vascolare, compresi i suoi effetti attraverso NO generazione nel endotelio. A causa di limitazioni di tecnologie di imaging, è stato virtualmente impossibile osservare movimentazione calcio all'interno del vaso intatto. Lo sviluppo dei due sistemi di imaging fotonica e la creazione di nuova di calcio o di coloranti di etichettatura, permette di immagine ad una profondità e una risoluzione sufficiente per iniziare a comprendere le dinamiche del calcio e la produzione di NO all'interno del sistema vascolare.
Microscopia a due fotoni è stata recentemente applicata in tessuti, organi e studi, compresi quelli interi a causa della sua superiore capacità di penetrare in profondità i tessuti con sfondo bassa fluorescenza e sensibilità segnale alto animale. 1,2 Lo spettro ristretto di due fotoni alla illuminatpunto focale ioni e l'uso di rilevatori non descanned sono le ragioni per cui due fotoni microscopia è superiore alla microscopia confocale tradizionale. Microscopia confocale non può produrre immagini di alta qualità alla profondità del tessuto necessario a causa della auto-fluorescenza e la dispersione di luce fuori fuoco nella pinhole confocale. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza un microscopio a due fotoni per misurare [Ca 2+] i segnalazione e produzione di NO in intatti, singole cellule dei vasi sanguigni con alta risoluzione ed un basso rapporto segnale-rumore.
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Protocollo
Le procedure sperimentali descritte qui di seguito sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso il Medical College of Wisconsin ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Isolamento del Topo Aorta
- Anestetizzare ratto con isoflurano (5% di induzione, 1,5 a 2,5% di manutenzione) o un altro IACUC metodo approvato.
- Posizionare il ratto in posizione supina. Al fine di mostrare gli organi addominali, fare una piccola incisione mediana ventrale attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo addominale. Uso garze deviano delicatamente gli intestini per esporre l'aorta e vena cava come mostrato in Figura 1.
- Brevemente, Blunt sezionare l'aorta dal tessuto connettivo e dalla vena cava. Utilizzando sutura, legare l'aorta più vicino possibile al rene. Sezionare circa 1 - 2 cm di aorta e mettetelo in una conica da 15 ml tuessere contenente normale soluzione salina fisiologica (PSS, in mm: 140 NaCl, 1.2 MgCl 2, 2 CaCl 2, 4.5 KCl, 6 Glucosio, 10 HEPES) su ghiaccio.
- Una volta che l'aorta è isolato, l'eutanasia degli animali secondo protocolli IACUC approvati. Al termine di tutti i non-sopravvivenza procedure euthanize animali profondamente anestetizzati di toracotomia inducendo pneumotorace per garantire la scomparsa umana dell'animale. 3
- Utilizzando un microscopio dissezione, pinze a punta fine, e microscissors sezionare il grasso e tessuto connettivo fuori dell'aorta. Una volta che l'aorta è pulito, tagliare l'aorta longitudinalmente e posizionarlo nella PSS in ghiaccio per dopo.
2. Dye Caricamento e incubazione
- Pipettare 7 ml di 1 mM Fluo-4 del mattino tintura, che viene fornito in soluzione basata DMSO-, in singole provette microlitri 500 che sono stati rivestiti con un foglio di alluminio. Conservare in congelatore a -20 ° C per preservare le proprietà di tintura nel corso del tempo. Nota: questi aliquotati cosìluzione dovrebbe essere stabile per almeno sei mesi.
- Prima dell'uso, lasciare che i soluzioni coloranti per riscaldarsi a RT prima dell'apertura. Preparare le soluzioni di lavoro immediatamente prima dell'uso. Non conservare il reagente diluito per un uso successivo.
- Aggiungere 7 ml di ready-made 1 mM Fluo-04:00 colorante sciolto in soluzione DMSO a 450 ul di PSS che non contiene calcio. Aggiungere 40 ml di soluzione al 10% di DMSO base non Acid Pluronic al cocktail di carico per contribuire a disperdere le acetossimetil (AM) esteri e migliorare il carico del colorante calcio.
- Posizionare le aorte sezionato nelle provette 500 microlitri contenenti il cocktail di carico (come descritto in 2.3) per 1 h. Coprire tutte le provette con pellicola e posto su un agitatore rotante a temperatura ambiente.
- Per monitorare la produzione di NO nel sistema vascolare, utilizzare DAF-FM diacetato colorante. Incubare l'aorta in una soluzione contenente 450 microlitri PSS, 40 microlitri di acido Pluronic e 5 ml di 10 mM DAF-FM diacetato. Simile al protocollo di incubazione di calcio (descritto al punto 2.3), posizionare l'aortain un tubo contenente 500 microlitri della soluzione di NO-dye coperto in stagnola e posto su un agitatore rotante per 30 minuti a 4 ° C seguita da successiva 30 minuti a RT.
- Quando la produzione di NO è misurata, utilizzare il endoteliale NO sintasi bloccante, L-NAME, per bloccare la produzione di NO come controllo come mostrato nella Figura 4B. Per tale procedura, di aggiungere cocktail (come descritto in 2.5) 100 nM L-NAME per gli ultimi 30 minuti di incubazione (a temperatura ambiente).
3. La scansione laser a due fotoni Microscopia Protocol
- Dopo il 1 h di incubazione, lavare l'aorta 2 - 3 volte a pulito PSS per rimuovere tintura extracellulare.
- Trasferire l'aorta a un piatto siliconata contenente sia PSS normale o Ca 2+ tampone -free (dipende dal protocollo sperimentale). Pin l'aorta giù sul rivestimento in silicone con avventizia in contatto con il silicone (cioè, lumen endoteliali esposti all'apertura piatto) utilizzando perni a forma μ. In alternativa, utilizzare una fetta di ancoraggiogriglia o colla per fissare il tessuto.
Nota: per ridurre lo stress e possibili artefatti meccanici, trasferimento e fissare dell'aorta in Ca 2 + -free soluzione e attendere 5 - 10 minuti prima di iniziare l'esperimento. - Collegare una pompa peristaltica o una siringa alla piastra siliconata per l'applicazione automatica o manuale di farmaci o per cambiare la soluzione extracellulare.
- Porre la capsula sotto il nasello del montante microscopio a due fotoni, e installare e posizionare un 25 × (NA 1,05 e distanza di lavoro 2 mm) acqua-immersion lente dell'obiettivo sopra il campione. Nota: Se questo obiettivo specifico non è disponibile, utilizzare un obiettivo specificamente fabbricati per l'imaging due fotoni, perché può aumentare la risoluzione del segnale notevolmente rispetto ad un obiettivo normale.
- Attivare il laser due fotoni utilizzando il software (il laser inizia a pompare e accendere). Tune l'eccitazione laser a 820 nm.
- Utilizzando epifluorescenza, individuare l'aorta e mettere a fuoco l'obiettivo sula superficie endoteliale utilizzando la regolazione grossolana.
- Accendere il microscopio in modalità di scansione laser a due fotoni, assicurando che il laser di eccitazione è la modalità di blocco, i rilevatori non descanned sono impegnati e sono installati i filtri di emissione adeguati per gli spettri di emissione previsto. Nota: Qui, il FV10-MRL / R (495-540 nM) sono stati utilizzati.
- Iniziare la scansione in tempo reale utilizzando la potenza del laser circa il 5% e finemente focalizzare l'obiettivo, al fine di visualizzare le cellule endoteliali.
Nota: le cellule endoteliali esporranno un segnale fluorescente forte quando incubate in condizioni normali PSS. Questo sarà notevolmente più debole quando i vasi sono incubati in tampone privo di calcio. Le cellule endoteliali saranno presenti sulla parte superiore dell'aorta aperto e le cellule muscolari lisce sono visibili appena sotto le cellule endoteliali (vedere Figura 2). Poiché i vasi sanguigni sono né liscia né, ci saranno luoghi in cui sono presenti sia le cellule muscolari lisce e cellule endoteliali. - Una volta che le cellule sono a fuoco, programmare il software del microscopio di raccogliere immagini in sequenza in modalità di scansione veloce (scansione raster, finestra 512 x 512 pixel con una frequenza di raccolta cornice di 1,1 s). In parallelo con Fluo-4:00 fluorescenza, raccogliere trasmesse immagini luce per rilevare variazioni vaso contrazione e visualizzare meglio le condizioni sperimentali.
- Dopo la raccolta di immagini di base dei segnali, modificare la concentrazione di ioni Ca 2+ nella soluzione esterna o lentamente applicare agenti farmacologici stimolo utilizzando la pompa peristaltica mentre imaging. Osservare l'aumento segnale fluorescente all'interno delle cellule caricate.
Nota: Le cellule endoteliali rispondono ai cambiamenti nel flusso, in tal modo si raccomanda di utilizzare applicazioni a bassa laminari e di prova del veicolo prima dell'applicazione di attivatori farmacologiche di Ca 2+ o NO segnalazione. Per ricalcolare calcio intracellulare a valori di concentrazione Nm navi cariche di Fluo-4 (costante di dissociazione per Fluo-4 is 345 nM), intensità di fluorescenza potrebbe essere registrato all'inizio dello studio e dopo l'aggiunta di ionomicina e MnCl 2. 4
4. Elaborazione delle immagini e calcoli
- Scaricare e installare Figi pacchetto di elaborazione delle immagini.
- Aprire il file di immagine in Fiji. Dopo l'importazione del file, dividere i canali (luce trasmessa e di segnale fluorescente) quando richiesto. Utilizzare solo il segnale fluorescente per l'analisi dei dati.
- Nell'ambito del programma Fiji, fare clic sulla scheda analizzare e scorrere verso il basso fino all'opzione strumenti. Sotto l'opzione strumenti, trovare la scheda che dice direttore ROI e fare clic su di esso; Apparirà una nuova finestra.
- Dopo questo, clicca su misurazioni impostati nella scheda analizzare. Selezionare le misure specifiche di interesse. Per le misure transitorie di calcio, utilizzare l'opzione valore medio grigio.
- Con lo strumento traccia circolare, iniziare a tracciare le regioni di interesse (ROI) e cliccare su "aggiungi" nella schermata direttore ROI per ogni ROI. Una volta che tutte le cellule di interesse sono stati rintracciati, nella finestra di gestione ROI, selezionare Misura Multi nella scheda "altro". Ricordati di salvare le misurazioni sia direttamente o copiare e incollare tutte queste misure in un foglio di calcolo.
- Aprire file * .txt o foglio di calcolo Excel da Fiji e trasferire i numeri per un nuovo foglio di lavoro di origine. Nota: in alternativa, usare qualsiasi programma come Sigma Plot o Prism per ulteriori analisi.
- Nell'ambito del programma di origine, utilizzare il menu Plot Linea + Simbolo → osservare una panoramica di tutte le risposte transitorie. Deselezionare le cellule non rispondono.
- Ricalcola il numero di traccia su scala temporale (asse X), utilizzare Colonna → Impostare valori di colonna e moltiplicare la colonna numero di traccia per la frequenza di raccolta di immagini (nel nostro caso 1.1s).
- Utilizzare Analisi → Statistiche su righe per tutte le registrazioni selezionate per calcolare Media (asse Y) e traccia errore standard. Tracciare Grafico finale per il gruppo attuale di cellule Plot → Linea + Symbol.
- Il mean calcolo transiente di calcio è descritto come seguito.
- Per diffusione totale del calcio all'interno del programma Origin, clicca su Grafico, quindi utilizzare il menu Analisi → calcolo → Integra. Integrante totale di area sotto la curva appare nel Registro dei risultati.
- Per cinetiche transitori, clicca su Grafico, quindi utilizzare il menu: Curva Analisi → non lineare Fit → Select Data Set (scegliere l'asse X vanno dal massimo al fine di risposta ai transienti). Inizia Fitting → Selezionare la funzione → decadimento esponenziale 1 → Fatto.
Nota: raccordo esponenziale appare nella finestra di Grafico e Risultato Log. I dati ottenuti (valori) rappresentano quantità totale di calcio rilasciato, e cinetica dei canali mediate la risposta transitoria.
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Risultati
Per valutare con precisione il contributo di calcio per la fisiologia vascolare (vasodilatazione e vasocostrizione), un protocollo è stato progettato per caricare coloranti calcio in entrambe le cellule endoteliali e le cellule muscolari lisce in isolato aortae intatto. Il sperimentale generale attuato illustrato nella figura 1, mostra la strategia di base per l'isolamento e la preparazione della nave prima di imaging. Brevemente, dopo l'isolamento dell'aorta dal ratto, deve essere pulito di...
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Discussione
Introduzione sperimentale. Per meglio comprendere l'apporto di calcio e NO alla fisiologia vascolare, un nuovo metodo è stato sviluppato per la misurazione [Ca 2+] i e NO all'interno muscolari lisce e cellule endoteliali dei isolate aorte intatti. Insieme, questo protocollo è composto da questi passaggi critici: 1) l'isolamento meccanico e preparazione (digestione enzimatica non) della nave. È importante mantenere il tessuto sano e intatto il più possibile avere registrazioni f...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. William Cashdollar, e la Northwestern Mutual Foundation Imaging Center presso il Sangue Istituto di ricerca del Wisconsin per un aiuto con gli studi di imaging. Ringraziamo anche il dottor Daria Ilatovskaya per la lettura critica di questo manoscritto e utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HL108880 (a AS) e DP2-OD008396 (per AMG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µ l in DMSO |
| Soluzione Pluronic F-68 | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Microscopio verticale Olympus | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti: laser zaffiro 690nm - 1040nm | |
| Filtri | Olympus | FV10-MRL/R | Da 495 a 540 nm |
| 25&volte; obiettivo a immersione in acqua | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 e distanza di lavoro 2 mm |
| Slice Anchor grid | Strumento Warner | SHD-27LH | |
| Altri reagenti di base | Sigma-Aldrich |
Riferimenti
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
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