Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

Summary

Presentiamo un test di geotassi negativa ottimizzato, economico e affidabile in Drosophila melanogaster come modello per i disturbi neurodegenerativi. Essendo più sensibile ai difetti locomotori lievi, questo test aiuterà a individuare potenziali interazioni genetiche e bersagli farmacologici.

Abstract

Difetti Locomotive derivanti da malattie neurodegenerative possono essere un sintomo di esordio tardivo della malattia, dopo anni di degenerazione subclinica, e quindi attuali strategie di trattamento terapeutico non sono curativi. Attraverso l'uso di sequenziamento exome, un numero crescente di geni sono stati identificati per giocare un ruolo nella locomozione umana. Nonostante l'identificazione di questi geni, non è noto come questi geni sono essenziali al funzionamento normale locomotiva. Pertanto, un test affidabile, che utilizza organismi modello per chiarire il ruolo di questi geni per identificare nuovi bersagli di interesse terapeutico, è necessaria più che mai. Abbiamo progettato una versione sensibilizzata del test geotassi negativi che consente il rilevamento di difetti lievi anteriore e ha la capacità di valutare questi difetti nel tempo. Il saggio viene eseguito in un cilindro graduato in vetro, che è sigillato con un film barriera di cera. Aumentando la distanza limite ad essere scalata a 17,5 cm ed aumentando la durata dell'esperimento per 2 min abbiamo osservato una maggiore sensibilità nella rilevazione disfunzioni mobilità lievi. Il test è conveniente e non richiede una formazione completa per ottenere risultati altamente riproducibili. Questo lo rende una tecnica eccellente per lo screening candidati farmaci in mutanti di Drosophila con difetti di locomozione.

Introduction

Malattie neurodegenerative devastanti come il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, e paraplegia spastica ereditaria sono sempre più riconosciuti. Sfortunatamente, la maggior parte di questi disturbi neurodegenerativi sono ancora senza trattamenti. L'uso clinico diffuso di test genetici, imparziali genoma come il sequenziamento dell'esoma ha portato ad un numero sempre maggiore di geni di essere coinvolto in disturbi locomotiva umani. Nonostante questi progressi, la progressione patologica dalla mattina presto alla fase avanzata, rimane inafferrabile in questi disturbi. Drosophila fornisce uno con gli strumenti genetici per lo studio requisito gene in modo spaziale e temporale controllato. Inoltre, Drosophila è dimostrato utile nello screening farmaci per malattie neurologiche come il Parkinson ^1, il morbo di Alzheimer ^2, ritardo mentale ed epilessia ^{3,4 5,6} tra gli altri. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un costo effettivoe il dosaggio affidabile che permetta di alta analisi rendimento che sarebbe ancora abbastanza sensibile per rilevare piccole variazioni nelle prestazioni del motore.

Ci sono diversi test utilizzati per quantificare gli effetti di mutazione genetica e / o le condizioni ambientali sul comportamento arrampicata Drosophila. La maggior parte dei saggi capitalizzare la naturale tendenza di mosche da scalare, noti come geotassi negativi, o il saggio arrampicata. Benzer ⁷ suggerito nel 1967 che l'apparato controcorrente utilizzato per lo studio di fototassi potrebbe anche essere usato per studiare gravitaxis. Da allora, Ganetsky ⁸ e molti altri ^{9 -12} hanno costruito sul dosaggio iniziale. Il principio è quello di mettere un numero noto di mosche in una fiala e toccare la fiala fortemente contro una superficie dura, causando linea a cadere sul fondo della fiala. Dato che è un comportamento innato, linea tenteranno di salire fino alla cima del flaconcino, al contrario di gravità. Questo test è quantitativa e measures quanti mosche sono saliti oltre un marcatore sul flacone nel corso di un periodo di tempo assegnato. Misurazione della velocità invece del numero totale di mosche arrampicata è diventata un parametro affidabile e mostrato difetti nei casi in cui il numero dei criteri mosche non era significativo ^13.

Il dosaggio arrampicata è dimostrata utile nello studio di molte malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson ^14. Tuttavia, abbiamo notato che i difetti locomotiva non deve essere rilevabile al momento in cui la neurodegenerazione è già visto in studi patologici ^14. Pertanto, l'uso del test tradizionale può limitare la capacità di studiare le prime fasi della patogenesi della malattia. La comparsa di difetti locomotiva durante le fasi successive di patologia può riflettere una malattia la cui progressione è troppo avanzato per la completa salvataggio.

Ciò solleva un potenziale problema con la sensibilità del tradizionale test arrampicata. Il potenziale incapacità del tradizionale arrampicata test di rilevare difetti locomotiva lievi può essere attribuito alla quota alla quale linea devono salire. Le tradizionali misure assay ^15,16 il numero di mosche a salire con successo su un'altezza di 2 a 5 cm di 10 a 20 sec.

Protocol

La ricerca sulle Drosophila melanogaster era conforme con l'Università di linee di ricerca di Alberta.

1. Fly Collection

1. Raccogliere 20 mosche con CO _{2 (g),} anestesia e posto in una fiala di raccolta 25 millimetri x 95 millimetri contenente cibo.
2. Fiale magazzini contenenti mosche orizzontalmente per evitare di intrappolare le mosche in liquidi che possono accumularsi sul fondo della fiala.
3. Incubare mosche per almeno 21 ore a 22 ° C a 45% di umidità in un incubatore per circa per 15 h. Impostare l'incubatore con una luce 12 ore: ciclo scuro.

2. Arrampicata Assay

1. La mattina seguente, il trasferimento di 20 mosche da una singola fiala in un bicchiere da 250 ml cilindro graduato. Segnare la posizione del cilindro per mantenere costante quotidiana. Utilizzare un cilindro di vetro per il genotipo per evitare la contaminazione incrociata tra i genotipi. Lavarsi alla fine di ogni esperimento e roli tate tra genotipi.
   1. Condurre gli esperimenti in luce ambiente (o la luce rossa se esiste un potenziale difetto visivo) rispettivamente a temperatura e umidità di 22 ° C e 40%. Per evitare di confondere circadiano ritmo, sempre esperimenti alla stessa ora del giorno.
2. Chiudere la parte superiore del cilindro con un film barriera (strato di cera) per evitare fuoriuscite di linea (Figura 2).
3. Impostare la videocamera su un treppiede. Fotocamera Focus sulla linea di 190 ml dei 250 ml cilindro graduato (17.5 cm).
4. Contare il numero di mosche morte sul fondo del cilindro e nelle fiale alimentari. Registrare questo numero come la mortalità.
5. Molto battere leggermente il cilindro contro un tappetino in gomma a cellule chiuse ripetutamente con forza sufficiente a spostare le mosche per la superficie inferiore interna. Toccare 5-10 volte, mentre con l'altra mano per premere registrare sulla fotocamera.
6. Premere il pulsante "Record" sulla fotocamera.
7. Avviare il video registrazione della videocamera e toccare il cilindro sei volte in un modello non ritmico distinti.
8. Condurre ogni prova per 2 minuti dal momento in cui le mosche sono ultimo sfruttato e registrare il numero di mosche che attraversano l'altezza di 17,5 cm (190 ml) per ogni punto temporale prescelto (quantificare ogni 10 sec). Nota: La marcatura sul cilindro ml varierà da un cilindro modello all'altro a seconda del diametro. Per evitare errori, misurare l'altezza di ogni cilindro utilizzato.
9. Una volta che il processo è terminato, disporre di mosche in etanolo al 95%.
10. Ripetere i passaggi 2,1-2,9 fino a quando tutte le repliche sono stati testati con mosche freschi ogni volta.
    Nota: Anche se 5 repliche possono essere sufficiente con una mutazione che ha un forte effetto sulla locomozione, 10 replicati biologici di 20 mosche (200 mosche) si consiglia di rilevare le differenze più piccole.
11. Al termine dell'esperimento, lavare i cilindri in lavastoviglie laboratorio e O secco / N per essere riutilizzato.

3. Analisi

1. Analyvideo ze di ogni volano prova. Ogni 10 secondi, registrare il numero totale di mosche che passano la linea di tiro.
   1. Se una mosca si arrampica indietro o scende, record che volano come -1 e contare il prossimo volo per attraversare la linea di destinazione come lo stesso numero del volo che è risalito verso il basso o è caduto. Ad esempio, se il ¹⁵ fly scende al di sotto della linea di tiro, il prossimo volo per attraversare la linea (16 ^th volano) è considerato il 15 ^° volo e non 16 ^°.
2. Sottrarre mortalità dal numero totale di linea (20) per ottenere il numero di mosche che rimangono nel processo. Ad ogni punto di tempo, ottenere la frazione di mosche sopra la linea di destinazione.
3. Tracciare ogni percentuale in ogni momento (vedi figura 3).
4. Analizzare le prestazioni al punto dati 120 secondi ed eseguire studente t-test quando sono presenti 2 gruppi o ANOVA e post-test per confronti multipli (con modifica Bonferroni per pianificati e non pianificati Tukey per comparisons). Il Kolmogorov-Smirnov test ¹⁷ ​​viene eseguita per l'accertamento normalità e varianza uguale ma anche per confrontare le distribuzioni del gruppo mutante al controllo.
5. Per presentare i dati su invecchiamento, tracciare la percentuale di mosche arrampicata a 120 secondi con le mosche di età diverse (2 giorni, 1 settimana, 2 settimane) per vedere se c'è un deficit progressivo (Figura 4).

Results

L'arrampicata è un comportamento forte e riproducibile. Infatti, un giorno di vita in linea wild-type di raggiungere le prestazioni arrampicata distanza del bersaglio in rapido (25 - 30 sec). Mosche mutanti presentano una serie di prestazioni da lieve (o ritardato) per completare l'incapacità di salire al bersaglio. Illustriamo questo qui con due diversi alleli mutanti. Il primo è una grave allele del gene spastin causata da una delezione completa del gene spastin (terme ^{5,75) 18.} In questa linea (terme ^...

Discussion

Drosophila ha già dimostrato di essere un ottimo modello di malattia ¹⁴ e altre malattie neurodegenerative ^1,2 di Parkinson. Oltre agli strumenti genetici disponibili in Drosophila, suo genoma è altamente conservata per geni coinvolti nei disordini neurologici ^19. L'avvento di ampi metodi di screening genetico genoma (compresi sequenziamento dell'intero esoma) è probabile che continuerà a fornire una più grande lista di geni candidati associati con disturbi del ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		Drosophila	Le scorte vengono selezionate in base agli esperimenti. La temperatura e l'umidità nella stanza e nell'incubatrice devono essere controllate e costanti per evitare che le mosche siano troppo statiche o troppo bagnate.
Videocamera			Qualsiasi videocamera digitale andrà bene. Assicurati che possano mettere a fuoco l'oggetto vicino.
Cilindro graduato	Kimble	20028W	Diversi modelli di cilindro graduato possono avere diametri diversi. È quindi importante misurare l'altezza.
Computer			Qualsiasi modello andrà bene. Abbiamo usato il computer per monitorare l'arrampicata delle mosche e registrare il numero di mosche in ogni momento.