Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

Sommario

Comet assay misura rotture del DNA, indotte da fattori diversi. Se tutti i fattori (ad eccezione di stress ossidativo) che causano danni al DNA sono mantenute costanti, la quantità di danni al DNA è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare comet assay per la misura indiretta di stress ossidativo.

Abstract

Organismi eucarioti superiori non possono vivere senza ossigeno; tuttavia, paradossalmente, l'ossigeno può essere dannoso per loro. La molecola di ossigeno è chimicamente inerte, relativamente perché ha due elettroni spaiati situati in diverse pi * orbitali anti-incollaggio. Questi due elettroni hanno spin paralleli, nel senso che ruotano nello stesso verso attorno al proprio asse. Per questo motivo la molecola di ossigeno non è molto reattivo. Attivazione di ossigeno può avvenire per due meccanismi differenti; sia attraverso la riduzione con un elettrone alla volta (riduzione monovalente), oppure attraverso l'assorbimento di energia sufficiente per invertire la rotazione di uno degli elettroni spaiati. Il risultato è la produzione di specie reattive ossidative (ROS). Ci sono un certo numero di modi in cui il corpo umano elimina ROS nel suo stato fisiologico. Se la produzione di ROS supera la capacità di riparazione, i risultati dello stress ossidativo e danni molecole diverse. Ci sono molti metodi diversi con cui lo stress ossidativo può essere measured. Questo manoscritto concentra su uno dei metodi denominati gel elettroforesi cellulare, noto anche come "comet assay", che consente la misurazione di rotture del DNA. Se tutti i fattori che causano danni al DNA, diverso da stress ossidativo sono mantenute costanti, la quantità di danno al DNA determinato tramite test cometa è un buon parametro di stress ossidativo. Il principio è semplice e si basa sul fatto che le molecole di DNA sono caricate negativamente. Una molecola di DNA intatto ha una grande dimensione tale da non migra durante l'elettroforesi. Rotture del DNA, tuttavia, se presente risultato in frammenti più piccoli che si muovono nel campo elettrico verso l'anodo. Frammenti più piccoli migrano più velocemente. Poiché i frammenti hanno dimensioni diverse il risultato finale della elettroforesi non è una linea distinta ma piuttosto un continuum con la forma di una cometa. Il sistema consente di quantificare il "comet" risultante e quindi delle rotture del DNA nella cellula.

Introduzione

Comet assay è stato sviluppato da scienziati svedesi Ostling e Johanson ^1. DNA è una molecola carica negativa. Durante l'elettroforesi, più piccole, i frammenti di DNA danneggiato viaggiano più velocemente verso un anodo caricato positivamente ^2. Più i frammenti di DNA, più veloce la loro migrazione verso l'anodo a formare un tipico "comet" con una "testa" composta intatta, DNA integro e una "coda" composto di frammenti di DNA danneggiati ^3. DNA danneggiato può essere riparato da diversi meccanismi nel corpo ^4, che mantengono la generazione di rotture del DNA abbastanza equilibrati ^5. Se, tuttavia, il saldo è a favore di rotture del DNA, le interruzioni possono accumularsi e finiranno contribuire allo sviluppo di una malattia.

Il nostro DNA subisce circa 0.000165% di danni in un determinato momento ^6. Singole rotture del DNA bloccati si riferiscono ad un difetto su uno dei due filamenti del DNA a doppia elicaconsiderando double-stranded rotture del DNA sono causati quando entrambi i filamenti della doppia elica del DNA sono danneggiati. Ci sono vari fattori che possono aumentare la quantità di rotture del DNA in un dato momento, quali l'età della cellula, fumo di sigaretta, vari farmaci o stress ossidativo ^7-9. Se tutti i fattori che portano a rotture del DNA avanzati sono mantenute costanti, quindi la quantificazione di rotture del DNA per mezzo di test della cometa è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo.

Il metodo di test della cometa è utilizzata sempre più oggi in medicina tra cui oftalmologia. Una ragione di ciò è che lo stress ossidativo è sempre più riconosciuto come un meccanismo patogenetico per varie malattie ^8-11 e comet assay è un metodo con cui lo stress ossidativo può indirettamente essere quantificato.

Protocollo

Studi sul test della cometa eseguite presso l'Università di Basilea, Dipartimento di Oftalmologia sono stati approvati dal Comitato Etico Locale di Basilea

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare Dulbecco tampone fosfato (PBS) (Ca ++, Mg ++ libero) soluzione aggiungendo PBS (1 L confezione) e 990 ml di dH ₂ O ai media. Regolare il pH a 7,4. Conservare a temperatura ambiente.
2. Preparare la soluzione di lisi: Per preparare 1.000 ml aggiungono 2,5 M NaCl (146,1 g), EDTA 100 mm (37,2 g) e 10 Trizma mm base (1,2 g) in dH ₂ O.
3. Preparare buffer per elettroforesi (NaOH 300 mm / 1 mM EDTA) con l'aggiunta di 30 ml di NaOH 10 M e 7,5 ml di 0,2 M EDTA, qb a 1500 ml dH ₂ O e mescolare bene. Il volume totale dipende dalla capacità di dialogo gel. Prima dell'uso, misurare il pH del tampone per assicurare un pH> 13.
4. Preparare tampone neutralizzazione contenente 0,4 M Tris (48.5 gm aggiunto a ~ 800 ml dH ₂ O, aggiustare il pH a 7,5), concentrato (& #62; 10 M HCl) a 1000 ml con dH ₂ O. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
5. Preparare soluzione colorante. Per etidio bromuro (EtBr, 10x Archivio, 20 mg / ml) aggiungere 10 mg di EtBr in 50 ml di dH ₂ O e conservare a temperatura ambiente. Per 1x Archivio - mescolare 1 ml con 9 ml dH ₂ O. PRUDENTE! Maneggiare EtBr con adeguata cautela in quanto è un noto cancerogeno.

2. Isolamento dei leucociti

1. Ottenere campioni umani di sangue (20 ml) con anticoagulante come l'eparina mediante puntura venosa.
2. Separare i linfociti utilizzando un separatore cellulare gradiente di densità come Histopaque.
   1. Brevemente, diluire il sangue in rapporto 1: 1 con PBS o RPMI (senza FBS) e lo strato di oltre 600 microlitri separatore cellulare liquido.
   2. Centrifugare 1.800 xg per 20 min a 4 ° C. Aspirare il coat 'buffy' in 3-5 ml di PBS / RPMI e centrifugato a 300 xg per 10 minuti per ottenere il pellet linfociti.
   3. Recuperare i linfociti da appena sopra confine tra PBS (RPMI) E separatore cellulare liquido, con una pipetta. Rimuovere le bande leucociti dall'interfaccia tra il plasma e il separatore di cella strati liquidi di ciascun tubo e raccogliere in una provetta da 50 ml.
3. Portare il volume totale di 50 ml con il freddo di Dulbecco modificato (DMEM). Lavare la sospensione cellulare tre volte con DMEM a 300 xg per 10 min.
4. Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro. Sospendere le cellule in PBS e aliquote in provette da microcentrifuga a 10 ⁷ cellule / tubo.
5. Pipettare 0,4 ml di cellule in 5 ml di plastica tubo usa e getta. Aggiungere 1,2 ml di 1% a bassa temperatura di gelificazione agarosio a 40 ° C. Mescolare e rapidamente e pipettare 1,2 ml di sospensione cellulare sulla superficie agarosio-coperto di un vetrino pre-rivestite. Evitare la produzione di bollicine.
6. Lasciare che il agarosio di gel per circa 2 minuti. Essere coerenti con il tempo e la temperatura utilizzata per la gelificazione, e garantire che agarosio sia completamente impostata prima di immergere in soluzione di lisi. Dopo completamente set, immergere in soluzione lisante a ~ 4 ° C.

3. Lysis e elettroforesi

NOTA: La procedura descritta è per elettroforesi in condizioni di pH> 13 alcaline.

1. Dopo almeno 2 ore a ~ 4 ° C, rimuovere delicatamente i vetrini dalla soluzione di lisi. Collocare i vetrini affiancati sulla scatola gel orizzontale vicino ad una estremità, scorrevole come vicino possibile.
2. Riempire i serbatoi tampone con appena fatto tampone pH> 13 elettroforesi fino a quando il livello del liquido copra completamente le diapositive (evitare bolle sul agarosio).
3. Lasciare diapositive sedersi in tampone alcalino per 20 min per consentire lo svolgimento del DNA e l'espressione di danni alcali-labili.
4. Attivare alimentazione a 25 volt (~ 0,75 V / cm) e regolare la corrente a 300 milliampere alzando o abbassando il livello del buffer. Elettroforesi i vetrini per 30 min.
5. Spegnere l'alimentazione. Sollevare delicatamente le diapositive dal buffer e ppizzo su un vassoio di scarico. Eliminare cappotto saggio i vetrini con la neutralizzazione Buffer. Lasciare i vetrini a sedere per almeno 5 minuti. Scolare diapositive e ripetere altre due volte.
6. Colorare i vetrini con 80 microlitri 1x etidio bromuro (EtBr) e lasciar riposare per 5 minuti e poi immergere in acqua distillata fredda per eliminare l'eccesso macchia. Poi posto un vetrino sul vetrino e archiviare immediatamente. Conservare i vetrini per un mese a temperatura ambiente in condizioni di asciutto.
   NOTA: Altri macchie DNA (ad esempio, SYBR-verde) può essere utilizzato anche. Attenzione! indossare guanti di protezione, come la maggior parte delle tinture sono mutageni.

4. Quantificazione delle rotture del DNA

1. Per visualizzare il danno al DNA, di osservare il vetrino DNA EtBr macchiato con un microscopio a fluorescenza obiettivo 40X.
2. Valutare danni DNA quantitativamente nelle cellule misurando la lunghezza di migrazione del DNA e la percentuale di DNA migrato (Figura 1A). Quantificare il danno al DNA (Figura 1B) dal momento in cui parti apribili e Olive-Moment. Definizioni di Tail-Moment e Olive -Moment sono stati precedentemente data ^8-10.
   NOTA: Nella nostra esperienza è abbastanza per attaccare da uno dei parametri. Le cellule sono fotografati impostando lo strumento automatico che analizza sulle celle vetrino da microscopio e fotografie. Quantificazione delle rotture del DNA può essere effettuata da pacchetti software di analisi delle immagini. Ci sono diversi pacchetti software differenti che sono realizzati su misura per catturare l'immagine delle cellule e quantificare il danno al DNA. Si consiglia di utilizzare lo stesso pacchetto software tutto l'esperimento. Il tecnico di laboratorio identifica la cellula intatta o una cometa da valutare sul computer e fa clic con il mouse su di esso. La cella cometa o intatto viene segnato automaticamente.

Risultati

Sebbene il metodo di test della cometa rende risultati riproducibili, può essere influenzata da una varietà di fattori. Uno di questi fattori è o meno i leucociti vengono crioconservati prima lisi e gel-elettroforesi o se questa operazione viene eseguita su leucociti appena preparati. La Figura 2 mostra che nel gruppo 2, dove sono stati crioconservati prima lisi e l'elettroforesi su gel ss- DNA leucociti pause erano significativamente più alti, rispetto al gruppo 1 dove lisi e gel -Elettroforesi è stato fatto su cellule preparate al momento.

Il dosaggio può anche essere utilizzato per valutare indirettamente stress ossidativo sistemico. La tabella 1 mostra le statistiche descrittive per fanalino posteriore momento e Olive- momento in fumatori e soggetti sani. I dati rivelano che il fumo mezzo pacchetto di sigarette al giorno raddoppia pause ssDNA nei leucociti circolanti ^9.

Figura 1. (A) raffigura il microscopio utilizzato durante l'analisi del test della cometa. (B) Δ raffigura una tipica "cometa" con una testa brillante e la coda (danneggiato frammenti di DNA più piccoli). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. pause ssDNA erano significativamente più alti quando i leucociti sono stati crioconservati (Gruppo 2) rispetto a quando leucociti preparati al momento sono stati utilizzati prima di lisi e gel elettroforesi.

Tabella 1. I fumatori avevano più del doppio del numero di interruzioni ssDNA rispetto a età e sesso abbinato non fumatori sani.

Discussione

Scienziati svedesi Ostling e Johanson sono stati i primi nel loro campo di utilizzare test della cometa per quantificare i danni del DNA nelle cellule ^1. Le condizioni neutre che i due scienziati hanno usato, tuttavia, solo permesso la rilevazione di doppio filamento rotture del DNA. Singh et al. In seguito adattato il test per l'uso in ambiente alcalino, che ha prodotto una versione sensibile che potrebbe valutare doppie e singole filamento rotture del DNA e di rilevare i siti alcali-labili ^12. Dal suo sviluppo iniziale, il test è stato modificato in varie fasi per renderlo adatto per valutare i tipi di danno al DNA in diversi tipi cellulari ^13-15.

Come per tutte le tecniche, prestando una rigorosa attenzione ai dettagli tecnici è importante per ottenere risultati accurati ^16. Sulla base della nostra esperienza, i migliori risultati si ottengono se ogni passo da metodologico preparazione soluzione cometa quantificazione-viene eseguita da esperti tecn laboratorioicians. L'utilizzo di mezzi freschi e correttamente preparato, adeguate tecniche di pipettatura, esatta tempistica e (come precedentemente menzionato nella sezione risultati) l'uso di leucociti preparati al momento sono essenziali per lisi e elettroforesi su gel di ottenere risultati accurati ^17.

Tutte le singole fasi di questo saggio sono ugualmente importanti per ottenere risultati affidabili. ¹⁶ In generale i migliori risultati si ottengono se ogni singolo passo metodologico dalla preparazione soluzione fino quantificazione cometa viene eseguita da esperti del laboratorio technicians.Important sembrano l'uso di mezzi freschi e correttamente preparati , adeguate tecniche di pipettatura, i tempi esatti e, come già di cui nella sezione dei risultati l'uso di leucociti preparati al momento per lisi e gel elettroforesi per ottenere risultati adeguati dal saggio ^17.

Come fare altre metodologie, la tecnica comet assay ha il suo advanTages e svantaggi. Essendo un metodo sensibile, il saggio è vulnerabile a fattori (ad esempio, raggi UV) che possono aumentare la rotture del DNA e quindi influenzare i risultati. Qualsiasi fattore che può aumentare lo stress ossidativo, ad eccezione di ciò che è oggetto di ricerca, dovrebbe essere evitato. Stress possono aumentare il livello di stress ossidativo non solo nei leucociti, ma anche in tutti gli altri mezzi di sangue e linfociti. Come detto in precedenza ci sono molti modi diversi e più dirette di misurare lo stress ossidativo ^18,19. Il saggio comet è uno dei molti metodi che ha alcuni vantaggi. Questi includono il suo costo relativamente basso, il piccolo numero di celle richieste (<10.000 cellule) e quindi i piccoli campioni di sangue necessaria per paziente, il periodo relativamente breve di tempo necessario per quantificare il danno del DNA in cellule (circa 3 giorni), la sua sensibilità e la sua diffusa applicabilità ai danni asini DNA in diversi tipi di cellule. In passato abbiamo scegliere di lavorare con leucociti da quando abbiamo avuto esperienza con questotipo cellulare ed era applicabile per un particolare studio previsto. Un altro vantaggio del comet assay è che può essere utilizzato per rilevare diversi tipi e livelli di danno al DNA e quindi può essere applicata in vari altri settori di studi oltre stress ossidativo quali studi di riparazione del DNA, trattamenti per il supporto o genotossicità.

Lo stress ossidativo è ora riconosciuto come giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi di diverse malattie. Il metodo comet assay, mentre uno dei molti modi per misurare lo stress ossidativo ^18,19, è relativamente semplice, versatile e poco costoso. Quando masterizzato, questo metodo può essere utilizzato in tutti i settori della medicina in cui lo stress ossidativo svolge un ruolo significativo ^8-10,20,21.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dimetilsolfossido (DMSO)	Qualigeni	(CPW59)
Disodio EDTA	HiMedia	(RM1370)
Bromuro di etidio	Sigma	(E-8751)
Histopaque	Sigma	(1077-1)
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Ca++, Mg++ free)	HiMedia	(TS1006)
Cloruro di sodio (NaCl)	Ranbaxy Rankem	(S0160)
Idrossido di sodio (NaOH)	BDH-Merck	(89021)
Triton X-100	HiMedia	(RM 845)
Trizma Base	Spectrochem
Materiali necessari per l'elettroforesi su gel
Agarosio a fusione normale (NMA)	HiMedia	(RM273)
Basso punto di fusione Agarosio (LMPA)	Sigma	(A9414)
Metanolo - Qualigens
Vetrini coprioggetti (n. 1, 24 x 60 mm)	Blue Star
Microcentrifuge Tubi	Tarsons	(500010)
Micropipettor e punte	Tarsons
Vetrini per microscopio, Vetrini

convenzionali / Micro gel per elettroforesi (MGE)