L'indagine sulla migrazione precoce delle cellule endoteliali (EEC) è importante per comprendere la fisiopatologia di alcune malattie e per identificare potenzialmente nuove strategie per l'intervento terapeutico. Il seguente protocollo descrive le tecniche per valutare la migrazione cellulare che sono state adattate per lo studio della CEE.
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Articolo metodologico
Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l'esposizione a sostanze chimiche tossiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'esposizione a sostanze chimiche (compresi alchilanti agenti di guerra chimica come mostarde zolfo e di azoto) provoca una pletora di sintomi clinici tra cui il disturbo di guarigione delle ferite. Il processo fisiologico di guarigione della ferita è molto complessa. La formazione di tessuto di granulazione è un passo fondamentale in questo processo con un conseguente chiusura preliminare ferita e fornendo una rete di nuovi vasi sanguigni capillari - sia attraverso vasculogenesi (romanzo di formazione) o angiogenesi (germinazione delle navi esistenti). Sia vasculo- e angiogenesi richiedono funzionale, la migrazione diretta delle cellule endoteliali. Così, l'indagine della migrazione precoce delle cellule endoteliali (CEE) è importante per capire la fisiopatologia della chimica indotta guarigione delle ferite e disturbi potenzialmente individuare nuove strategie di intervento terapeutico.
Abbiamo valutato difficoltà nella guarigione dopo alchilanti esposizione agente e testati potenziali composti candidati treatment. Abbiamo usato una serie di tecniche descritte in questo protocollo. Una camera di Boyden modificato per investigare quantitativamente chemochinesi di CEE è descritta. Inoltre, l'uso di guarigione della ferita test in combinazione con analisi pista per valutare qualitativamente migrazione è illustrato. Infine, dimostriamo l'uso del TMRM colorante fluorescente per la ricerca del potenziale di membrana mitocondriale per identificare i sottostanti meccanismi della migrazione cellulare disturbato. Il protocollo che segue descrive le tecniche di base che sono state adattate per la ricerca di CEE.
Introduzione
La migrazione delle cellule è importante in molti processi fisiologici e fisiopatologici, tra cui lo sviluppo, varie malattie, e la guarigione delle ferite dopo lesioni della pelle.
Dopo lesioni della pelle, infiammazione rimuove unità tessuti e granulazione danneggiati o necrotiche chiusura preliminare ferita e permette la formazione di una rete di nuovi capillari attraverso vasculogenesi (formazione romanzo) o angiogenesi (germinazione di vescicole esistenti) 1-3. Sia vasculo- e angiogenesi richiedono migrazione delle cellule endoteliali. La crescente rete di vasi sanguigni è essenziale per il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive al proliferare cheratinociti che alla fine subiscono cheratinizzazione, formare un nuovo epitelio e fornire la chiusura della ferita.
La migrazione deteriorate delle cellule endoteliali è una causa di fondo di guarigione delle ferite disturbo 4,5. Così, i metodi per valutare la migrazione delle cellule endoteliali primi sono tenuti a esplorare la pathophysiollogia dei disturbi di migrazione delle cellule e di individuare nuove strategie di intervento terapeutico.
Esposizione cutanea ad agenti alchilanti (ad esempio, zolfo e mostarde azoto) provoca la guarigione della ferita disturbo 6. Tali composti sono stati utilizzati come agenti di guerra chimica in molti conflitti nel 20 ° secolo e rimangono motivo di forte preoccupazione a causa di scorte esistenti in regioni politicamente instabili e relativamente semplice sintesi. Anche se la senape di zolfo fu sintetizzato nel 1822, la patologia molecolare e clinica di esposizione SM non è compreso nei dettagli e un antidoto per l'esposizione SM è stato identificato.
Sono stati condotti numerosi studi per comprendere e modellare difficoltà nella guarigione dopo l'esposizione SM e per testare potenziali composti candidati capaci di riservare tale effetto. Schmidt et al. (2009) testato l'effetto di clorambucile, un composto alchilante con proprietà simili a SM in moumodelli corpo embrioide sé e ha trovato una drammatica, a volte riduzione oltre il 99% in formazione dei vasi 7. Questo effetto negativo è stato più pronunciato in una fase di sviluppo che, in condizioni fisiologiche, è dominato dalla proliferazione e la migrazione delle cellule precursori endoteliali vascolari. Così, queste cellule sono state identificate per essere particolarmente sensibile agli agenti alchilanti. Steinritz et al. (2010) testato scavengers di specie reattive dell'ossigeno (ROS), in particolare N-acetilcisteina (NAC) e acido linolenico alfa (ALA) per la loro capacità di ridurre la tossicità SM in modelli di topo embrioide corpo e in particolare, per ripristinare la formazione dei vasi 8. Sono stati osservati effetti protettivi temporanei, che indica che l'eccessiva formazione di ROS è stato in grado di contribuire agli effetti negativi della SM sulla guarigione delle ferite. Questi effetti non sono permanenti e due composti candidati possono non essere in grado di ripristinare la formazione dei vasi e la guarigione della ferita a lungo termine 8. However, quegli esperimenti sono stati condotti in un modello complesso in 3D che ha fatto autorizzazione di indagare su migrazione cellulare. Così, abbiamo successivamente testato NAC e ALA per gli effetti benefici sulla migrazione cellulare di CEE, che hanno un ruolo chiave nel processo di formazione dei vasi 9.
Inoltre, è dimostrato che la polarità cellulare è necessaria per la migrazione delle cellule. Disfunzione mitocondriale che porta alla formazione di ROS ha dimostrato di ridurre la polarità delle cellule e può quindi influenzare negativamente la migrazione delle cellule. Pertanto, cellule vive quanto riguarda la funzione mitocondriale è stata eseguita e gli effetti di scavengers ROS sono stati esaminati. Il protocollo che segue descrive i requisiti generali per la coltivazione della CEE, del test camera di Boyden, la guarigione della ferita test tra cui l'analisi di monitoraggio delle cellule e l'uso di TMRM per la valutazione della funzione mitocondriale nei dettagli. Aspetti importanti di protocolli sperimentali per la coltivazione CEE e la migrazione sono evidenziati.
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Protocollo
Il protocollo che segue descrive le tecniche per lo studio della migrazione delle cellule endoteliali presto. La corretta coltivazione di cellule endoteliali vascolari richiede pre-rivestimento dei fiasche di coltura cellulare con gelatina per garantire la corretta proliferazione e la manutenzione di un fenotipo endoteliale.
1. Pre-rivestimento di cella cultura palloni
- Sciogliere la gelatina in 0,1 M PBS ad una concentrazione finale di 0,1%.
- Autoclave la soluzione con i parametri per autoclave liquido (per dettagli vedere le istruzioni dell'autoclave specifico).
- Aggiungere volume sufficiente di soluzione di gelatina autoclavato in un pallone di coltura cellulare sterile (ad esempio, almeno 5 ml per un pallone di coltura di cellule T25).
- Trasferire i flaconi in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2 non è necessaria, ma non interferisce) per almeno 30 min.
- Rimuovere la soluzione di gelatina rimanente. Utilizzare i palloni preverniciati successivamente (vedi coltura cellulare) o store in condizioni sterili fino al momento dell'uso.
2. Cella coltivazione delle antiche cellule endoteliali
Nota: cellule staminali embrionali derivate prime cellule endoteliali (CEE) sono state ottenute da differenziati corpi embrionali murine per separazione delle cellule magnetica attivata della frazione di cellule positive PECAM-1 come descritto in precedenza 10,11.
- Culture CEE su gelatina rivestite piatti di coltura cellulare in DMEM supplementato con 15% FCS, 50 U / ml di penicillina, 50 U / ml di streptomicina, 200 mM L-glutammina, 100 mM ß-mercaptoetanolo e 1% di aminoacidi non essenziali. Gestire le cellule in condizioni sterili. Coltivare le cellule con 5% di CO 2 a 37 ° C e 95% di umidità fino sub-confluenza (max. 80%).
- Al sub-confluenza, dividere le celle in un rapporto 1: 5. Nota: Il distacco delle cellule endoteliali è un passaggio fondamentale.
- Raccogliere le cellule con RT accutase. Rimuovere i supporti, risciacquare con PBS e aggiungere 1 ml di accutase per 25 centimetri 2.
- Incubare la muffola a temperatura ambiente per 2-10 minuti fino a quando le cellule sono distaccato. Disperdere le cellule e trasferirli l'applicazione desiderata. Nota: Una neutralizzazione chimica del accutase non è richiesto come avviene quando le cellule seminate sono memorizzati in incubatrice a 37 ° C. Tuttavia, accutase attività può essere diminuita aggiungendo DMEM contenente FCS.
3. Boyden Chamber
Nota: saggi camera di Boyden vengono effettuate utilizzando sistemi di inserti di polietilene tereftalato chiaro opaco con 8 micron dimensione dei pori.
- Pre-coat gli inserti del filtro (che si adattano all'interno pozzetti di coltura cellulare creando così una camera di Boyden) aggiungendo 500 ml di 0,1% di gelatina disciolti in 0,1 M PBS per almeno 30 min.
- Se le cellule devono essere esposti a sostanze chimiche tossiche, esporre secondo il disegno sperimentale specifico prima raccolta di cellule. Nota: Le cellule sono state esposte a 12,5 mcg clorambucil / ml DMEMper 24 ore. Per quanto riguarda il disegno sperimentale specifico, le istruzioni possono variare.
- Harvest CEE e determinare il numero di cella utilizzando una camera di conteggio delle cellule. Nota: Distributori automatici di conteggio possono essere utilizzati, ma devono essere usati con cautela: conteggio manuale delle cellule è più preciso ed è altamente raccomandato.
- Aggiungere 500 microlitri terreno di coltura cellulare nel vano camera inferiore della camera di Boyden.
- Aggiungere esattamente 10 4 CEE in 500 microlitri terreno di coltura cellulare per inserto filtro nel vano camera superiore. Eliminare le bolle.
- Incubare gli inserti del filtro in incubatrice per esattamente 8 ore.
- Risciacquare una volta con PBS e sostituire il mezzo con 0,5 ml di 4% paraformaldeide in entrambi gli scomparti per 25 minuti per la fissazione delle cellule. Lavare il filtro ampiamente ma almeno 3 volte con 0,1 M PBS.
- Accise le membrane con un bisturi.
- Montare la membrana tra due vetrini di vetro con il mezzo di montaggio contenente DAPI per stainin nucleareg. Prestare attenzione all'orientamento. Assicurarsi che solo le cellule che sono migrati verso il lato vano inferiore della membrana vengono contati.
- Contare le cellule che sono migrati verso il lato vano inferiore della membrana con un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 400X. Non confondere pori della membrana con le cellule migrate (Figura 1A, 1B). Indagare un numero ragionevole di repliche biologiche (almeno 3 repliche biologiche per condizione).
4. Wound Healing Assay
- A seconda della dotazione disponibile, scegliere con cura i piatti di coltura cellulare o piastre: Quando si utilizza la microscopia DIC, evitare di superficie plastica piatti della cultura basato o pozzetti ma utilizzare dispositivi basati su vetro, invece.
Nota: Se si utilizza la microscopia a contrasto di fase, piatti di plastica a base possono essere usati anche. - Coltivare CEE in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio, 4 centimetri di vetro Petri fondo adatto per l'imaging cellulare dal vivo) Fino all'80% di confluenza. Importante: non coltivare le cellule per completare confluenza.
- Gratta monostrati con sterili 10 consigli microlitri pipetta. Spingere la punta delicatamente senza troppa pressione sulla superficie piatto e spostarlo in linea retta agevolmente da un lato al other.Wash le cellule due volte con 0,1 M PBS per rimuovere le cellule staccate.
- Aggiungere un volume sufficiente di mezzo al piatto di coltura. Se del caso, aggiungere i composti che devono essere esaminati.
Nota: 1.5 ml di mezzo contenente 15 ng / ml alfa è stato aggiunto acido linolenico. - Montare il piatto di coltura al microscopio capace di imaging cellulare dal vivo. Assicurare 5% di CO 2, 37 ° C e atmosfera umidificata.
Nota: umidificazione è particolarmente importante per evitare evaporazione media. - Acquisire time-lapse immagini oltre 24 ore a intervalli di 10 min. Piano per file di grandi dimensioni. Nota: Una risoluzione di 512 x 512 pixel è generalmente sufficiente; tuttavia, si consiglia di utilizzare le immagini di almeno 1.024 x 1,024.
- Misurare la fessura su t = 0 ore e al tempo t = 24 ore utilizzando lo strumento lunghezza del software fornito con il microscopio o utilizzare software open source (per esempio, ImageJ). Nota: In generale software specifico di acquisizione e analisi delle immagini è fornito dal produttore. Pertanto, per i dettagli tecnici relativi all'uso del software, consultare il manuale.
Monitoraggio 5. cellulare
- A seconda della dotazione disponibile, scegliere con cura i piatti di coltura cellulare o piastre: Quando si utilizza la microscopia DIC, evitare di superficie plastica piatti della cultura basato o pozzetti ma utilizzare dispositivi basati su vetro, invece.
Nota: Se si utilizza la microscopia a contrasto di fase, piatti di plastica a base possono essere usati anche. - Seme 5 x 10 4 CEE in DMEM integrato in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio, 24-pozzetti) e coltivare le cellule con 5% di CO 2 a 37 ° C e 95% di umidità per 1-2 giorni.
- Quando le cellule sono cresciuti fino ad un 80% Confluenza, rimuovere i media e la cultura delle cellule con i nuovi media, in presenza dei rispettivi sostanze di prova (ad esempio, 12,5 mcg chlorambucil / ml DMEM). Sempre includere cellule di controllo (trattati con il solvente, ad esempio, etanolo) a 37 ° C per un certo periodo di tempo (24 ore, a seconda del sistema di dosaggio individuale).
- Montare il piatto di coltura al microscopio capace di vivo imaging cellulare (37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità). Acquisire time-lapse immagini oltre 24 ore a intervalli predefiniti. Acquisire immagini a intervalli di 10 min.
- Eseguire il monitoraggio manualmente della CEE con l'uso del plugin ImageJ MTrackJ. Scegli 10 celle a caso dal campo visivo e seguire i loro movimenti con l'aggiunta di un punto dati per ogni punto nel tempo utilizzando il "Aggiungi" il comando di MTrackJ.
Nota: MTrackJ è disponibile gratuitamente presso e ImageJ è disponibil [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le a [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Un manuale dettagliato sul plugin MTrackJ è disponibile a "http://www.imagescience.org".
6. Imaging cellulare dal vivo / Valutazione del potenziale di membrana mitocondriale
- Coltivare CEE in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio 4 cm vetro Petri inferiore adatto per l'imaging cellulare dal vivo) fino ad una confluenza di 80%.
Importante: Non coltivare le cellule per completare confluenza. - Se del caso, esporre le celle a sostanze chimiche. Nota: Le cellule sono state esposte a 12,5 ug / ml clorambucile per 24 ore. Per quanto riguarda il disegno sperimentale specifico, le istruzioni possono variare.
- Preparare una soluzione 10 stock mM di tetrametilrodamina (TMRM) in DMSO. Proteggere dalla luce. Nota: La soluzione madre può essere conservata a -20 ° C.
- Diluire la soluzione madre in mezzo di coltura cellulare per una soluzione di lavoro con una concentrazione di 10 mM (1: 1.000) diluizione. Proteggere dalla lucee utilizzare il più presto possibile. Nota: La soluzione di lavoro può essere conservata a temperatura ambiente per un certo tempo (> 1 ora), tuttavia, la preparazione di una soluzione di lavoro fresco è altamente raccomandato.
- Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro per 1 ml di mezzo (soluzione di caricamento) fresco coltura cellulare.
- Caricare le cellule sostituendo il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di carico. Incubare per 15 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 e l'atmosfera umidificata (incubatore). Attenzione: Quasi tutti gli indicatori di fluorescenza vengono esportati dalle cellule nel tempo vivente; quindi evitare di caricare prolungata o analisi ritardato.
- Senza lavaggio, mettere il piatto sotto un microscopio adatto per l'imaging cellulare dal vivo. Importante: gli indicatori di fluorescenza sono molto sensibile alla luce, quindi, evitare l'esposizione alla luce non necessaria.
- Acquisire le immagini senza modificare i parametri di acquisizione per garantire la comparabilità tra le immagini differenti.
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Risultati
Esposizione cutanea ad agenti alchilanti provoca eritema, formazione di bolle e ulcere cutanea che è associato con un disturbo guarigione della ferita. La guarigione della ferita richiede vasculogenesi angio e che si basano sulla migrazione delle cellule endoteliali. Migrazione quantitativa può essere valutata mediante l'uso del dosaggio camera di Boyden. Come mostrato nella Figura 1C esposizione CEE al clorambucile agente alchilante determinato una significativa diminuzione migrazione cellulare
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Discussione
Esposizione cutanea a sostanze chimiche tossiche si traduce spesso in grave disturbo guarigione delle ferite. I meccanismi alla base sono in gran parte sconosciuti. La guarigione della ferita è un processo complesso che si compone di diverse fasi (emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento). Migrazione cellulare è coinvolto in ogni fase, tuttavia, è di fondamentale importanza per la formazione del tessuto di granulazione. Qui, nuovi vasi sanguigni si formano mediante angio o vasculogenesi.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero della Difesa tedesco (Grant No. M-SAB1-6-A009).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Camera di Boyden | |||
| Inserti trattati con coltura tissutale (TC) Corning FluoroBlok, 24 pozzetti - 3 &; m | Corning Incorporated | #351151 | |
| Inserti trattati con coltura tissutale (TC) Corning FluoroBlok, 24 pozzetti - 8 & micro; m | Life Sciences | #351152 | |
| per l'uso con Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| di guarigione delle ferite | |||
| Piatti con fondo in vetro | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Valutazione del potenziale | |||
| TMRM (estere metilmetilrodamina di tetrametilrodammina) | Life Technologies | #T669 | |
| Coltura | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria# | L11-007 | |
| &alfa;-Acido linolenico | Fluka (Sigma), Steinheim, Germania | # L2376 | |
| Clorambucile | Fluka (Sigma), Steinheim, Germania# | 23125 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania | # G2500-100G |
Riferimenti
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
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