Qui, presentiamo un protocollo per l'infusione diretta stereotassica cerebrale di amiloide-beta. Questa metodologia fornisce un modello murino alternativo in vivo per affrontare gli effetti a breve termine dell'amiloide-beta sui neuroni cerebrali.
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Articolo metodologico
Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattia di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa che colpisce la popolazione. Una caratteristica neuropathological fondamentale della malattia è l'eccessiva produzione di beta-amiloide e la deposizione di beta-amiloide placche nelle regioni del cervello degli individui afflitti. Nel corso degli anni gli scienziati hanno generato numerosi modelli del mouse della malattia di Alzheimer che tentano di replicare il beta-amiloide patologia. Purtroppo, i modelli di topo solo selettivamente imitano le caratteristiche della malattia. La morte neuronale, un effetto importante nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer, è notevolmente carente in questi topi. Quindi, noi ed altri abbiamo impiegato un metodo di infondere direttamente solubili specie oligomeriche di beta-amiloide - forme di beta-amiloide, che hanno dimostrato di essere più tossico per i neuroni - stereotaxically nel cervello. In questo rapporto utilizziamo maschi C57BL / 6J per documentare questa tecnica chirurgica di aumentare i livelli di beta-amiloide in una selezione regione del cervello. Ilbersaglio infusione è il giro dentato dell'ippocampo perché questa struttura cerebrale, insieme al proencefalo basale che è collegata dal circuito colinergico, rappresenta una delle aree di degenerazione nella malattia. I risultati di elevare beta-amiloide nel giro dentato tramite infusione stereotassica rivelano aumenti di perdita di neuroni nel giro dentato entro 1 settimana, mentre vi è un concomitante aumento della morte cellulare e la perdita di neuroni colinergici nel ramo verticale della banda diagonale di Broca del proencefalo basale. Questi effetti sono stati osservati fino a 2 settimane. I nostri dati suggeriscono che il beta-amiloide modello infusione attuale prevede un modello alternativo del mouse per affrontare regione specifica morte dei neuroni in una base a breve termine. Il vantaggio di questo modello è che amiloide-beta può essere elevato in modo spaziale e temporale.
Introduzione
Depositi di placca amiloide, che sono composti di beta-amiloide (A? 1-42), sono un elemento chiave della patologia della malattia di Alzheimer (AD). Numerosi studi hanno dimostrato che i livelli elevati o tossici di ricombinante oligomeri Ap 1-42 suscitare morte neuronale, sinaptica la distrofia, perdita e disfunzioni; così come apprendimento e memoria deficit 1-4. Regioni cerebrali colpite sono l'ippocampo, la corteccia, e le strutture sottocorticali, come prosencefalo basale e il 5,6 amigdala. Ad oggi, ci sono più modelli di topi transgenici che tentano di simulare l'Ap 1-42 patologia di AD. A seconda d....
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Protocollo
Nota: Per tutti sperimentazione animale, istituzionale e le linee guida nazionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio sono stati seguiti.
1. Preparare Strumenti chirurgici e soluzioni per la chirurgia
- Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox.
- Preparare 70% di etanolo diluendo 200 prova etanolo assoluto con grado molecolare acqua distillata deionizzata sterile.
- Attaccare l'ago G 29 alla siringa Hamilton. Pulire l'interno della siringa Hamilton e l'ago attraverso l'elaborazione e l'acqua espulsione Nanopure ripetutamente per 1 min. Ripetere questa procedura c....
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Risultati
L'attuale metodo di preparazione umana ricombinante oligomeric Ap 1-42 produce specie oligomeriche solubili costituiti da monomeri, dimeri, trimeri e tetrameri (Figura 1A). Questi a basso peso molecolare Ap 1-42 specie, ma non le fibrille e placche, sono state esposte in numerose impostazioni per essere più tossico per i neuroni 1,4,9,17-19. Per determinare se oligomerica Ap 1-42 induce la morte dei neuroni nel cervello di topo Ap 1-42 (4 ml di .......
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Discussione
Per ottenere un successo Ap 1-42 iniezione lo sperimentatore o chirurgo deve: 1) utilizzare una tecnica asettica; 2) identificare correttamente la regione del cervello di interessi con coordinate precise; 3) essere in grado di rendere sicure le mouse nella telaio stereotassico con il cervello livellato sull'asse AP e ML; 4) avere la capacità di operare il micromanipolatore con precisione; 5) assicurare una corretta assistenza post-operatoria. Osservando tali passaggi chiave il mouse dovrebbe sopravvivere .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke concedere NS081333 (CMT), Alzheimer sovvenzione dell'Associazione NIRG-10-171.721 e Istituto Nazionale di Salute Mentale concessione MH096702 (UH), e National Institute on Aging, finanziato la ricerca sulle malattie di Alzheimer Center presso la Columbia University di sovvenzione pilota AG008702 (a YYJ e JB).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ketamina HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg di ketamina per 1 kg di |
| xilazina animale (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | non disponibile | 10 mg di xilazina per 1 kg di |
| buprenex (0,3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0,1 mg di buprenex per 1 kg di |
| A&beta animale; 1-42 | David Teplow/UCLA | non disponibile | 100 μ M; Questa amiloide è stata utilizzata nell'articolo |
| Aβ 1-42 | Bachem | H-1368 | Può essere utilizzato al posto dell'amiloide dal laboratorio Teplow |
| Aβ 1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Può essere utilizzato al posto dell'amiloide proveniente dal laboratorio Teplow |
| Scrambled Aβ 1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Può essere utilizzato come peptide di controllo per confrontare Aβ 1-42 |
| Anticorpo NU4 (anticorpo amiloide oligomerico) | Dono di William Klein/Northwestern U. | non disponibile | Diluizione 1:2.000 |
| Anticorpo oligomerico anti-amiloide (Coniglio policlonale) | EMD Millipore | AB9234 | Può essere utilizzato al posto di Nu4; deve essere testato dall'utente finale |
| 6E10 Anticorpo (topo monoclonale) (anticorpo amiloide) | Biolegend | sig-39320 | Diluizione 1:1.000 |
| Anticorpo ChAT (capra policlonale) | Millipore | AB144P | Diluizione 1:100 |
| DeadEnd Sistema TUNEL fluorimetrico | Promega | G3250 | Seguire le indicazioni del produttore per utilizzare |
| il reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPI | Invitrogen | P36935 | Utilizzare quando si scivolano i vetrini |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | non disponibile | soluzione al 2% |
| Etanolo assoluto (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Per produrre etanolo al 70% per la sanificazione e la disinfezione del |
| gel di tricina Novex 10-20% | Life Technologies | EC6625BOX | Per separare Aβ 1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | Per l'esecuzione di gel di tricina al 10-20% Tampone |
| di trasferimento Novex Tris-glicina (25X) | Life Technologies | LC3675 | Per il trasferimento di gel di tricina al 10-20% SuperSignal |
| Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | Per migliorare Aβ segnale 1-42; seguire il protocollo del produttore |
| Protran BA79 Membrana per tamponamento alla nitrocellulosa, 0,1 μ m | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | Per il trasferimento del 10-20% di gel di tricina |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Elettroforesi aparato per l'esecuzione di gel di tricina al 10-20% |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | non disponibile | Per mantenere gli occhi del topo umidi durante l'intervento chirurgico; può essere trovato nei negozi di farmacia locale |
| [header] | |||
| Refresh Optive Lubrificante Collirio | Allergan | non disponibile | Per mantenere umidi gli occhi del topo durante l'intervento chirurgico; può essere trovato nelle farmacie locali; Può essere utilizzato al posto di GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | Per igienizzare e disinfettare |
| la spatola rotonda/conica. | VWR | 82027-490 | Per l'apertura della bocca di un animale |
| Bulldog Serrefines Clamps (Dim. ganascia 9X1,6 mm; Lunghezza 28 mm) | Strumenti per le scienze fini | 18050-28 | Opzionale; Per tenere la pelle del cuoio capelluto separata durante l'iniezione |
| Forbici dritte e fini (tagliente 25 mm; Lunghezza 11,5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | Per tagliare il cuoio capelluto |
| #3 Manico per bisturi | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Lama chirurgica | Fine Science Tools | 10011-00 | Per eseguire l'incisione del cuoio capelluto |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2,5x1,5 mm; Lunghezza 11,5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | Per tenere chiuso il cuoio capelluto durante la sutura |
| Kit combinato rifinitore | Kent | Scientific CL9990-1201 | Per la rasatura dei capelli |
| T/Pump Ricircolatore d'acqua calda | Kent Scientific | TP-700 | Per riscaldare l'animale durante l'intervento chirurgico |
| Tappetino da guerra riutilizzabile (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | Per collegarlo al ricircolo dell'acqua calda T/Pump per riscaldare l'animale durante l'intervento chirurgico |
| Micro trapano a batteria | Stoelting | 58610 | Utilizzare frese in acciaio da 0,8 mm per praticare fori nel cranio |
| Strumento stereotassico standard da laboratorio con mouse e Adattatore per ratto neonatale | Stoelting | 51615 | |
| Solo per lo strumento stereotassico del topo | Stoelting | 51730 | Può usarlo al posto di Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotassico Iniettore | Stoelting | 53311 | |
| Sterilizzatore per perline di vetro secco | Stoelting | 50287 | Per la sterilizzazione di strumenti in acciaio inossidabile |
| Telo chirurgico sterile (18 "x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Siringa 50 ml, modello 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | Per iniezione cerebrale; utilizzare siringhe diverse per soluzioni diverse |
| 29 G Ago, mozzo piccolo RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | Per il collegamento alla siringa Hamilton per iniezione cerebrale |
| 1 ml BD Siringhe per tubercolina | VWR | BD309659 | Per la somministrazione di anestesia e soluzione salina |
| Ago da 30 g (0,5") | VWR | BD305106 | Per la somministrazione di anestesia e soluzione salina |
| Bilancia elettronica portatile serie CS (Ohaus) | VWR | 65500-202 | Per pesare gli animali per determinare la dose di anestesia |
| Piastra riscaldante (Dim. piastra superiore 7,25x7,25 pollici) | VWR | 47751-148 | Per il riscaldamento degli animali dopo l'intervento chirurgico |
| Sutura in seta di seta Sofsilk Taglio C-1 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | Per la chiusura della ferita |
| Vetbond Adesivo tissutale (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Opzionale: per facilitare la chiusura della ferita; Utilizzare con sutura. |
| Applicatori sterili con stelo in legno con punta in cotone | Fisher scientific | 22-029-488 | Per la pulizia e l'asciugatura di ferite chirurgiche |
| Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | Per la raccolta di sezioni cerebrali |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | Per il montaggio di vetrini per microscopio |
| Thermo Scientific Nalgene Filtro per siringa 0,2 μ m | Fisher Scientific | 194-2520 | Per la sterilizzazione della soluzione salina |
| Marcatori cutanei sterili a doppia punta di Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | Per la marcatura delle coordinate sul cranio |
Riferimenti
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
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Ristampe e permessi
