Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per l'incapsulamento di cellule cataboliche, che consumano lipidi per la produzione di calore nel tessuto adiposo intra-addominale e aumentano la dissipazione di energia nei topi obesi.

Abstract

Incapsulamento delle cellule è stato sviluppato per intrappolare cellule vitali all'interno delle membrane semi-permeabili. Le cellule incapsulate trapiantate possono scambiare metaboliti a basso peso molecolare in tessuti dell'ospite trattato per conseguire sopravvivenza a lungo termine. La membrana semipermeabile permette innestato cellule incapsulate per evitare il rigetto da parte del sistema immunitario. La procedura di incapsulamento è stato progettato per consentire un rilascio controllato di composti bioattivi, come l'insulina, altri ormoni e citochine. Qui si descrive un metodo per l'incapsulamento di cellule catabolici, che consumano lipidi per la produzione di calore e la dissipazione di energia (termogenesi) nel tessuto adiposo intra-addominale di topi obesi. L'incapsulamento di cellule catabolici termogenica potrebbe essere potenzialmente applicabili alla prevenzione e il trattamento dell'obesità e il diabete di tipo 2. Un'altra potenziale applicazione di cellule catabolici può includere la disintossicazione da alcool o altri metaboliti tossici e inquinanti ambientali.

Introduzione

L'aumento dell'incidenza delle malattie croniche ¹ ha stimolato studi sul trapianto di popolazioni di cellule terapeutiche ^2. Le cellule staminali singenici o allogeniche sono i tipi di cellule più comunemente usati per queste applicazioni ^2. Tuttavia, questi trattamenti non consentono il controllo della differenziazione e migrazione delle cellule staminali dopo l'impianto e non sono convenienti. Il trapianto di cellule geneticamente modificate con funzioni benefiche anticipa migliorare il trattamento di molte malattie. Tuttavia, le modifiche genetiche di cellule vengono riconosciuti dal sistema immunitario dell'ospite, quindi, questi trattamenti richiedono immunosoppressione ^3. L'incapsulamento di cellule che producono l'insulina è stato sviluppato dal Dr. Chang ^4. La tecnica si basa sulla incapsulamento delle cellule in goccioline alginato che vengono immerse in una soluzione di cloruro di calcio. Molecole alginato consistono di acido mannuronico (M) e guluronico (G) e possono essere collegati da Ca ²⁺. Dopo gelificazione, le perle sono sospese una soluzione di poli-L-lisina (PLL). Durante questa fase, PLL lega al G e M nelle molecole alginato che stabilisce membrana della capsula. La porosità della membrana della capsula può essere modulata variando le concentrazioni M e PLL, il tempo di incubazione, e la temperatura. Il legame del PLL dipende anche dal tipo e dalla concentrazione di alginato. Matrici alginato reticolato con ioni Ca ^2+, sono instabili in ambiente fisiologico o in soluzioni tampone comuni con alta concentrazione di fosfato e ioni citrato. Questi buffer possono estrarre Ca ²⁺ dal alginato e liquefare il nucleo. Liquefazione del nucleo alginato fornisce spazio all'interno delle capsule per il movimento e la crescita cellulare. Cellule incapsulate in alginato polyanionic con policationico poli-L-lisina (APL) sono impermeabili per immunoglobuline ma hanno afflusso di nutrienti e l'efflusso di tossine. Queste proprietà consentono APL lungo termine survival di cellule incapsulate dopo il trapianto in host geneticamente diverse. Elliott et al. Riportato la sopravvivenza di funzionamento delle cellule pancreatiche suina incapsulati in un paziente umano nove anni dopo l'impianto ^5.

Tecniche di incapsulamento possono essere classificati in microincapsulazione (3-800 micron) e macroincapsulazione (maggiore di 1000 micron). Le microcapsule sono più durevoli macrocapsules ^6. Fin dalla sua scoperta dal Dr. Chang e colleghi nel 1964, microincapsulazione è stato ampiamente utilizzato per l'incapsulamento delle cellule anabolizzanti che producono insulina, altri ormoni e molecole bioattive ^7. Questi trattamenti hanno affrontato diverse sfide nel tessuto ospite tra cui la fibrosi e la risposta immunitaria ^8. Inizialmente, gli effetti collaterali legati alla qualità dei biopolimeri sono stati risolti. Tuttavia, il trapianto di cellule anabolizzanti avvia ancora effetti collaterali, quali la fibrosi, come risultato di ormone overproduzione di fuori di una ghiandola specializzata.

Negli ultimi decenni, l'obesità e il diabete di tipo 2 ha raggiunto proporzioni epidemiche ^9. Più del 30% delle persone adulte in tutto il mondo sono in sovrappeso e obesi ^10. Aumento intra-addominale (IAB) la formazione di grasso aumenta l'incidenza di infiammazione cronica e promuove diabete di tipo 2, le malattie cardiovascolari, alcuni tipi di cancro, e di altre patologie ^11-13. Molte evidenze suggeriscono che la patogenesi associato con il grasso IAB può essere evitato dagli adipociti specifici. Recenti studi hanno dimostrato che il trapianto di adipociti sottocutanei in regione IAB può migliorare il metabolismo e ridurre l'obesità e insulino-resistenza nei roditori in vivo ^14. Efficace riduzione di obesità e insulino resistenza è stata associata con adipociti termogenica grado di dissipare l'energia sotto forma di calore ^15,16. Modifica termogenica adipociti può essere ottenuto mediante trasfezione stabiledi geni che partecipano al disaccoppiamento protonico mitocondriale, come la proteina di disaccoppiamento 1 (Ucp1) o di geni che regolano l'espressione di altri geni Ucp1 e termogenica ^15,16. Nostri studi recenti hanno dimostrato che la deficienza in aldeide deidrogenasi 1 a1 (Aldh1a1) porta al rimodellamento termogenico di grasso IAB che riduce l'obesità e insulino-resistenza in questi topi ^17,18. In particolare, l'incapsulamento di termogenico Aldh1a1 carente (Aldh1a1 - / -) preadipocytes media stesso effetto terapeutico di grassi IAB in obesi topi wild-type, suggerendo nuove opportunità terapeutiche per il trattamento di IAB grasso ^18. Nelle impostazioni sperimentali, le cellule incapsulate permettono ai ricercatori di studiare gli effetti di specifiche popolazioni cellulari in modo economicamente vantaggioso ^19. Qui si discute il metodo di incapsulamento di una linea cellulare catabolico termogenica e il suo laboratorio e applicazione terapeutica in un modello murino di obesità. Il protocollo descrive three fasi per la produzione di microcapsule (Figura 1): la formazione delle microsfere di alginato (Figura 1A), la formazione del policationico poli-L-lisina (PLL) membrane sulla superficie di microsfere (Figura 1B), e la rimozione del nuclei di alginato (Figura 1C).

Protocollo

Il protocollo di studio è stato approvato da The Ohio State University comitati etici. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal protocollo IACUC. Tutte le procedure sono state eseguite sotto l'armadio di livello 2 di biosicurezza con flusso laminare. Abbiamo seguito tutti i requisiti e le procedure di sicurezza standard. La tecnica di microincapsulazione per la preparazione di microcapsule è stata eseguita come descritto ^{17, 18.}

1. Preparativi di materiali

1. Preparare 10 ml di 2% di soluzione di alginato di sodio in soluzione salina fisiologica autoclavato (0,9% NaCl in acqua). Preparare 0,05% soluzione PLL in salina fisiologica. Preparare queste soluzioni il giorno prima e mescolare durante la notte. Filtrare le soluzioni con 0,22 micron filtro prima dell'uso.
2. Preparare citrato di sodio 50 mM e 100 mM CaCl ₂ 0.9% soluzioni di NaCl e sterilizzare in autoclave.
3. Autoclavare tutti soluzioni, aghi, elettrodi, e bicchieri. Pulire accuratamente aghi puliti con fili per evitare intasamenti.
4. Determinare la quantità appropriata di cellule da utilizzare per le capsule (102 microcapsule sono necessari per ogni cm ² di pozzo e ci sono circa 500 cellule per capsula ^18). Usare 1 ml di alginato di sodio per due milioni di cellule.
5. Preparare una 'crescita dei fibroblasti Medium' di siero di vitello contenente il 10%, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina in un alto livello di glucosio (4.500 mg / l di glucosio) a medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM).
   1. Preparare una 'Differenziazione medio I' contenente 10% di siero fetale bovino, 10 ug / ml di insulina, 1 mM dexametasone, 0,5 mM xantina 3-isobutil-1-metil, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina DMEM.
   2. Preparare contenente siero un 'Differenziazione medio II' 10% fetale bovino, 10 ug / ml di insulina, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina DMEM.
6. Preparare buffer di lisi contenente tablet inibitore della proteasi uno per 10 ml di Radio-Immunoprecipitazione tampone (RITampone PA).

2. alginato Microbeads Preparazione (Figura 1A)

1. Rimuovere il vecchio mezzo da pallone di coltura cellulare. Lavare le cellule con 10 ml di PBS. Portare le cellule in sospensione con 0,25% tripsina-EDTA (2 ml per un pallone T175 confluenti).
2. Contare le cellule in sospensione di cellule utilizzando un emocitometro. Utilizzare 10 ml un'aliquota dalla sospensione cellulare e contare le cellule secondo le istruzioni del produttore. Centrifugare le restanti cellule in terreno centrifugazione a 480 xg a temperatura ambiente per 5 min.
3. Sospendere il pellet cellulare in alginato di sodio, come descritto al punto 1.4. Trasferire la soluzione di sodio alginato-cella a una siringa da 5 ml.
4. Rimuovere le bolle d'aria nella soluzione, aggiungere un ago 23-gauge e capovolgere la siringa per creare una tasca 1 ml di aria.
5. Mettere un piccolo bicchiere (180 ml) contenente 144 ml di CaCl mM soluzione 100 ₂ sotto il beccuccio ago della encapsulator. Collegare l'elettrodo al encapsulator con la punta approximdiatamente 2,5 centimetri sopra la superficie della soluzione di CaCl ₂ 100 mM.
6. Inserire saldamente la siringa contenente la soluzione di alginato di sodio-cellule nella pompa a siringa. Attaccare il tubo di gomma per l'apertura della siringa. Spingere lo stantuffo fino a quando la soluzione di alginato di sodio a cellule entra a metà del tubo. Regolare la tensione di 5,4 kV. Impostare il diametro 12,06 millimetri sulla pompa a siringa. Regolare la velocità di 3 ml / h. Avviare la pompa. Accendere encapsulator e mantenere la tensione a 5,4 kV.
7. Chiudere la finestra della cappa ed evitare inutili vibrazioni fino alla fine della formazione delle microsfere di alginato. Dopo tutta la soluzione passa attraverso l'ago, solidificare microsfere sferiche alginato nella soluzione di CaCl ₂ 100 mM per ulteriori 20 minuti prima del rivestimento con PLL.

3. Microbeads rivestimento con PLL (Figura 1B)

1. Rimuovere il bicchiere contenente le microsfere a forma di palla di sodio alginato-cellula e trasferire questi microbeads in una provetta da centrifuga da 50 ml. Rimuovere CaCl soluzione ₂ dal pellet microperla.
2. Lavare le microsfere a forma di palla alginato di cellule aggiungendo 30 ml di NaCl allo 0,9%. Agitare il tubo a mano delicatamente. Rimuovere 0,9% NaCl con 25 ml pipetta dopo le microsfere sono precipitati per gravità. Ripetere altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
3. Utilizzare 10 ml di soluzione PLL 0,05% per ogni 1 ml di soluzione di alginato di sodio. Aggiungere il PLL 0,05% e agitare a 1000 giri al minuto per 10 min.
   Nota: Di solito, 10 min è sufficiente per il rivestimento PLL.
4. Dopo si forma PLL cappotto, rimuovere la soluzione PLL e lavare le capsule 3 volte come descritto al punto 3.2.

4. Rimozione di alginato core (Figura 1C)

1. Aggiungere 30 ml di 50 mM soluzione di citrato di sodio. Attendere 5 minuti o fino a quando tutta l'alginato di sodio è disciolto. Lavare capsule tre volte come descritto al punto 3.1.1.
2. Rimuovere il 0,9% NaCl, aggiungere 20 ml di mezzo di coltura al tubo 50 mle trasferire tutte le capsule contenenti le cellule in un pallone di coltura cellulare. Maneggiare cellule incapsulate in condizioni standard di coltura cellulare ^18.

5. Le domande vitro per lo studio xenotrapianto e Host cellulari interazioni o Cinetica di Metabolita Afflusso / Efflux tra cellule (Figura 2)

1. Cellule ospiti Cultura il 24 pozzetti fino confluenti per co-culture. Utilizzare il 'fibroblasti crescita medio' per preadipocytes coltura.
2. Trasferire microcapsule in 24 piastra contenente cellule ospiti confluenti bene. Aggiungere microcapsule per ottenere un monostrato (102 microcapsule / cm ² di pozzo).
3. Indurre la differenziazione pre-adipociti con Differenziazione Media I. Ogni 48 ore, cambio media differenziazione Media II per sei giorni. Lisare le cellule in tampone RIPA. Utilizzare 50 proteine ​​g per condizione di analizzare l'espressione proteica con Western Blot.

6. In Vivo Domanda di Trattento di obesità (figura 3)

1. Mescolare 4% isoflurano con l'ossigeno per l'induzione di anestesia e 2% isoflurano con ossigeno per il mantenimento dell'anestesia. Confermare adeguata profondità dell'anestesia per pizzico piedi.
   1. Applicare una pomata anti-prurito sugli occhi per proteggere le cornee si secchi.
2. Utilizzare cellule incapsulate che sono etichettati in modo permanente con proteina fluorescente artificiale, come la proteina fluorescente verde (GFP).
3. Utilizzare una siringa da 3 ml e un ago calibro 20 per iniettare cellule incapsulate.
   1. Iniettare 0,5 x 10 ⁶ cellule sospese in 0,2 ml di soluzione in ciascuno depot grasso catetere che si trova nella zona intraperitoneale tra un gonadi e reni come mostrato in figura 3. Utilizzare questo volume di PBS e il numero di cellule per topo con un peso medio di 40 g. Regolare numero di cellule e volume in topi che hanno peso diverso o per la determinazione degli effetti dose-dipendente.

Risultati

La Figura 1 mostra che ogni fase della produzione microsfere può essere controllato al microscopio. La Figura 2A mostra come co-coltura adipociti con un monostrato di cellule incapsulate. Figura 2B è un esempio rappresentativo di uno studio quantitativa utilizzando adipociti / microcapsule co-culture sono stati descritti nella sezione 5. Lisati degli adipociti sono stati analizzati usando Western Blot. Cellule incapsulate non sono state analizzate in questo esperimento....

Discussione

Vari metodi sono stati utilizzati per incapsulare cellule, comprese l'essiccazione, estrusione, ed emulsione ^19. In questo metodo, le perline alginato vengono estrusi attraverso un ago, poi rivestito con PLL e il nucleo alginato sarà sciolto per completare l'incapsulamento. Anche se questo metodo è stato usato per anni, formazione delle perline con la dimensione desiderata e la forma sferica è ancora difficile. La dimensione delle capsule è fortemente dipendente dalla viscosità della soluzione di algi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dispositivo di incapsulamento (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	Nessuno
Pompa a siringa KD scientific	KD scientific	780100Y	Nessuno
Microscopio Olympus	Olympus Optical	IX70-S8F2	Nessuno
Alginato di sodio	Sigma	MKBP8122V	Nessuno Bromuro
di poli-L-lisina (PLL)	Sigma	020M5006V	Nessuno
Cloruro di calcio	Sigma	SLBJ2662V	Nessuno
Citrato di sodio tribasico diidrato	Sigma	030M0200	Nessuno
Cloruro di sodio	Sigma	SLBD2595V	Nessuno Gel
Mini-PROTEAN TGX	Bio-Rad	456-1093	Nessuno
Anticorpo primario ATGL (da coniglio)	Segnalazione cellulare	2138S	Nessuno
Anticorpo secondario (anti coniglio)	LI-COR	926-68071	Nessuno
Tampone per test di radioimmunoprecipitazione (RIPA)	Boston BioProducts	D25Y6Z	Nessuno
Tamponato con fosfato soluzione salina (PBS)	Sigma	RNBD2893	Nessuno
Tripsina	Gibco	25200-056	Nessuno
Cortizone 10 unguento anti-prurito	Cortizone 10	C4029138	Nessuno
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Nessuno
Siero neonato di vitello (CS)	Sigma	N4762	Nessuno
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma	F4135	Nessuno
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma	I0516	Nessuno
Desametasone	Sigma	D4902	Nessuno
Insulina (bovina)	Sigma	I5879	Nessuno
Compresse da cocktail con inibitore della proteasi	Roche	4693159001	Nessuno