La trasfezione nella linea cellulare dei macrofagi, RAW264.7, è difficile a causa della risposta naturale della cellula contro i materiali estranei. Abbiamo descritto qui una procedura delicata ma robusta per la trasfezione dei geni reporter della luciferasi in cellule RAW264.7.
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Articolo metodologico
Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene
In questo articolo
Sommario
Abstract
La trasfezione dei materiali genetici desiderati in cellule è una procedura inevitabile negli studi di ricerca biomedica. Sebbene siano stati descritti numerosi metodi, alcuni tipi di cellule sono resistenti a molti di questi metodi e producono una bassa efficienza di trasfezione1, ostacolando potenzialmente la ricerca in quei tipi di cellule. In questo protocollo, presentiamo una procedura di trasfezione ottimizzata per introdurre geni reporter della luciferasi come DNA plasmidico nella linea cellulare di macrofagi RAW264.7. Vengono descritti due diversi tipi di reagenti di trasfezione (a base di lipidi e a base di poliammine) e vengono fornite note importanti in tutto il protocollo per garantire che le cellule RAW264.7 siano minimamente alterate dalla procedura di trasfezione e che tutti i dati sperimentali ottenuti siano i risultati diretti del trattamento sperimentale. Sebbene l'efficienza di trasfezione non sia superiore rispetto ad altri metodi di trasfezione, la procedura descritta è sufficientemente robusta per rilevare il segnale della luciferasi in RAW264.7 senza modificare la risposta fisiologica delle cellule agli stimoli.
Introduzione
La trasfezione di acidi nucleici nelle cellule ha un'applicazione diversificata nella ricerca scientifica. Gli esempi includono (1) geni reporter per studiare il ruolo dei diversi elementi di gene espressione genica, (2) plasmidi di espressione proteica per overexpress la proteina di interesse, e (3) small interfering RNA downregulate espressione genica. Manipolando il livello di espressione di particolari geni e misurando l'effetto differenziale di tali manipolazioni, i ricercatori possono dedurre le funzioni geniche nei sistemi biologici scelti. Non tutti i metodi di trasfezione forniscono la stessa efficienza di trasfezione, e anche lo stesso metodo di trasfezione non trasfettare tutti i tipi cellulari parimenti 1. Quindi, diversi metodi di trasfezione sono stati sviluppati come metodo di fosfato di calcio, DEAE destrano, cationico lipidi trasfezione, cationico trasfezione polimero non lipidi, elettroporazione, e nucleofection 2,3.
Transfection in macrofagi è especialmente difficile a causa del fatto che i macrofagi sono fagociti professionali che sono molto sensibili a materiali estranei, tra cui i batteri derivati (metilato) DNA 4. Introduzione di DNA estraneo attiva la via Toll-like receptor 9 (TLR9) che porta alla produzione di citochine e ossido nitrico 5,6. Questi macrofagi attivati possono quindi essere meno sensibili al trattamento che i ricercatori intendono esaminare.
Il nostro laboratorio transfects regolarmente la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 con geni reporter luciferasi, e abbiamo sviluppato un protocollo che è abbastanza robusto per avere segnale luciferasi significativamente superiore a quello di fondo, ma anche abbastanza delicato per i macrofagi di rimanere al loro stato di riposo. I comportamenti delle cellule trasfettate sono state valutate da un gene reporter luciferasi di lucciola-ospitare la regione del promotore di IκBζ (pGL3- IκBζ). Espressione IκBζ è upregulated dalla parete cellulare batterica componente labbroopolyssacharide (LPS) 7,8, e downregulated dalla citochina anti-infiammatoria, interleuchina-10 (IL-10) 8. Per tenere conto delle variazioni trasfezione tra pozzi, abbiamo co-trasfettare un plasmide di controllo che contiene il gene della luciferasi Renilla (ad esempio, phRL-TK) a fini di normalizzazione. Il protocollo descritto è ottimizzato dopo test vari parametri tra cui tempi di trasfezione, tipo di reagenti di trasfezione, quantità di reagenti e trasfezione di DNA plasmidico, così come rapporto di reagente di trasfezione di DNA plasmidico. I due reagenti di trasfezione compresi in questo protocollo sono (1) un reagente di trasfezione base lipidica e (2) una proteina / basato poliammina-trasfezione reagente.
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Protocollo
1. plasmide DNA Purification
- Estrarre DNA plasmidico utilizzando un kit maxiprep secondo il protocollo del produttore. Risospendere plasmide DNA in 500 ml di tampone TE.
- Eseguire un fenolo: cloroformio: estrazione di alcool isoamilico e isopropanolo precipitazioni per rimuovere i contaminanti batterici residue. La presenza di LPS interferisce con trasfezione 9.
- Aggiungere 500 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1, pH 8) al DNA plasmide e agitare energicamente per 15 sec. Fenolo provoca gravi ustioni cutanee ed è un anestetico così ustioni non sono sempre sentito fino a quando vi è un danno grave. Eseguire fenolo: estrazione isoamilico nella cappa e usare cautela: cloroformio.
- Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 13.000 xg per 10 min a RT. Trasferire 350 ml di fase acquosa superiore in una nuova provetta di raccolta da 1,5 ml.
- Aggiungere 350 microlitri di tampone TE alla provetta che contiene la fase organica inferiore. Agitare energicamente per 15 sec. Centrifugare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 350 ml di fase acquosa superiore allo stesso tubo di raccolta da 1,5 ml.
- Aggiungere 70 ml di 3 M acetato di sodio (pH 5.2) e mescolare bene. Aggiungere 700 ml di isopropanolo al 100%. Mescolare bene e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 13.000 xg per 10 minat 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 500 ml di etanolo al 75% al pellet. Campioni Vortex di mescolare e centrifugare a 5000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. DNA è in pellet.
- Aprire il tappo del tubo e asciugare il pellet a temperatura ambiente per 5 - 10 min. Il pellet dovrebbe diventare trasparente. Aggiungere 500 ml di tampone TE per risospendere il pellet di DNA. Riscaldare a 50 - 60 ° C per 10 minuti per sciogliere il pellet di DNA.
- Misurare l'assorbanza a 260 nm (A260) e 280 nm (A280) con uno spettrometro. Calcolare la concentrazione di DNA moltiplicando il valore A260 da 50 ng / ml. Valutare la qualità del DNA da parte calculating il rapporto A260 / A280. DNA con alta qualità dovrebbe dare un rapporto A260 / A280 di 1,8-2,0.
2. Coltura cellulare e Seeding
- Culture cellule RAW264.7 in DMEM supplementato con siero fetale di vitello 9% (DMEM / 9% FCS) a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Durante ogni passaggio, staccare le cellule dalla piastra pipettando continuo utilizzando una pipetta Pasteur. Passage le celle ogni 2 giorni, e sementi 1,5-2.000.000 cellule su un piatto di coltura di tessuti trattati 10 centimetri come il magazzino. Scongelare un nuovo stock di cellule ogni 5-6 settimane.
- Il giorno della trasfezione, sementi 200.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in un volume di 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare le cellule per 4 ore in C incubatore 37 °.
- Cellule transfect sia con il reagente a base lipidica (passo 3.1) o del reattivo a base di poliammine proteine / (punto 3.2).
3. Trasfezione
- A base di lipidi trasfezione:
- Riscaldare il reagen trasfezionet a Rt nel buio. Warm up mezzo privo di siero e DMEM / 9% FCS a 37 ° C.
- Aggiungere 0,5 pg di DNA plasmidico a 50 ml di mezzo privo di siero in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 2 ml di reagente di trasfezione con la punta della pipetta di sotto della superficie del liquido. Vortex per 6 secondi.
- Lasciare la miscela reagente / DNA al buio a temperatura ambiente per 30 min.
- Durante la 30 min di incubazione, rimuovere il supporto dal bene e aggiungere 250 ml di fresco DMEM / 9% FCS per ogni bene.
- Dopo 30 min, aggiungere 250 ml di DMEM / 9% FCS per la miscela reagente / DNA. Mescolare bene pipettando su e giù.
- Aggiungere 300 microlitri della miscela diluita in ciascun pozzetto. Incubare per 2 - 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore prima stimolazione cellulare.
- Proteine / a base di poliammine-trasfezione:
- Warm up privo di sieromedio e DMEM / 9% FCS a 37 ° C.
- Aggiungere 0,75 ml di reagente di trasfezione a 18,75 ml di terreno privo di siero. Vortex brevemente per miscelare. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 0,5 ml di 1 mg / ml di DNA nel reagente transfettate diluito. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Durante i 10 minuti di incubazione, rimuovere il supporto da ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti e aggiungere 250 microlitri DMEM fresco / 9% FCS per ogni bene.
- Dopo 10 min, aggiungere 250 ml di DMEM / 9% FCS nella miscela reagente / DNA.
- Aggiungere 270 microlitri della miscela diluita al pozzo. Incubare in un incubatore CO 2 37 ° C e 5% per 2-4 ore.
- Rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
4. La stimolazione cellulare e luciferasi Assay
- Sostituire media negli bene con 250 ml di fresco DMEM / 9% FCS.
- Aggiungere 50 ml di LPS o LPS + IL-10 Alle concentrazioni desiderate al pozzo. Riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Stimolare per 2-6 ore.
- Rimuovere la soluzione stimolazione mediante aspirazione, lavare con ghiaccio freddo PBS e aggiungere 200 ml di 1x Passive Lysis Buffer. Roccia a temperatura ambiente per 30 min. Raschiare e trasferire il lisato provette da 1,5 ml e rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Trasferimento 40 ml di lisato eliminato (surnatante) a una, chiara fondo piastra a 96 pozzetti bianco per la determinazione di segnali luciferasi secondo il protocollo del produttore.
- Leggere il segnale luciferasi con un luminometro attraverso l'intero spettro della luce visibile.
Analisi 5. I dati
- Calcolare la lucciola: rapporto Renilla dividendo valori individuali di luciferasi di lucciola dai valori di Renilla luciferasi da ogni pozzetto.
- Calcolare il fold change dividendo la lucciola: Renilla rapporto tra il trattato bene daquella del pozzo non trattato.
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Risultati
Figura 1 confronta l'efficienza di trasfezione dei due reagenti di trasfezione in RAW264.7. Il reagente a base lipidica tipicamente dato circa il 25% tasso trasfezione mentre la trasfezione basata poliammina-proteina / portato in circa il 5% di efficienza (Figura 1A). La differenza in termini di efficienza di trasfezione è stata anche osservata in segnali luciferasi in cellule RAW264.7 trasfettate con il promotore giornalista pGL3-IκBζ (Figura 1B). L'aggiunta di...
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Discussione
Il protocollo qui descritto non si concentra esclusivamente sulla efficienza di trasfezione, ma ha lo scopo di trovare un equilibrio tra efficienza e la conservazione degli stati fisiologici delle cellule. In particolare, la nostra procedura riesce a ridurre al minimo la tossicità di reagente di trasfezione e massimizzare il segnale luciferasi.
Un passo critico nel protocollo è la salute delle cellule. Culture Overgrown non sono adatti per la trasfezione come loro cambiamenti fisiologia e co...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione del Canadian Institutes for Health Research (CIHR). STC è titolare di un premio di dottorato per la ricerca dal CIHR e dalla Michael Smith Foundation. EYS è titolare di una borsa di studio CIHR. Il programma di formazione sui trapianti del CIHR ha anche fornito borse di studio per laureati a STC, EYS e SS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit PureLink HiPure Plasmid Maxiprep | Life Technologies | K210007 | Qualsiasi kit maxiprep funzionerà |
| Fenolo: cloroformio: alcol isoamilico | Life Technologies | 15593-049 | Grado di biologia molecolare. Il fenolo è tossico, quindi lavorare nella cappa aspirante, se possibile. Utilizzare lo strato organico trasparente inferiore se nel contenitore si formano due strati di liquido. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso. |
| Siero fetale bovino | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inattivato a 56 gradi C bagnomaria per 45 minuti prima dell'uso. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Riscaldare almeno a temperatura ambiente prima dell'uso. |
| Reagente di trasfezione XtremeGene HP DBA | Roche | 6366236001 | Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. |
| 5x tampone per lisi passiva | Promega | E1941 | 30 ml è incluso nel sistema di analisi Dual Luciferase |
| Reporter Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
Riferimenti
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336(2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
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