La trasfezione nella linea cellulare dei macrofagi, RAW264.7, è difficile a causa della risposta naturale della cellula contro i materiali estranei. Abbiamo descritto qui una procedura delicata ma robusta per la trasfezione dei geni reporter della luciferasi in cellule RAW264.7.
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Articolo metodologico
Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene
In questo articolo
Sommario
Abstract
La trasfezione dei materiali genetici desiderati in cellule è una procedura inevitabile negli studi di ricerca biomedica. Sebbene siano stati descritti numerosi metodi, alcuni tipi di cellule sono resistenti a molti di questi metodi e producono una bassa efficienza di trasfezione1, ostacolando potenzialmente la ricerca in quei tipi di cellule. In questo protocollo, presentiamo una procedura di trasfezione ottimizzata per introdurre geni reporter della luciferasi come DNA plasmidico nella linea cellulare di macrofagi RAW264.7. Vengono descritti due diversi tipi di reagenti di trasfezione (a base di lipidi e a base di poliammine) e vengono fornite note importanti in tutto il protocollo per garantire che le cellule RAW264.7 siano minimamente alterate dalla procedura di trasfezione e che tutti i dati sperimentali ottenuti siano i risultati diretti del trattamento sperimentale. Sebbene l'efficienza di trasfezione non sia superiore rispetto ad altri metodi di trasfezione, la procedura descritta è sufficientemente robusta per rilevare il segnale della luciferasi in RAW264.7 senza modificare la risposta fisiologica delle cellule agli stimoli.
Introduzione
La trasfezione di acidi nucleici nelle cellule ha un'applicazione diversificata nella ricerca scientifica. Gli esempi includono (1) geni reporter per studiare il ruolo dei diversi elementi di gene espressione genica, (2) plasmidi di espressione proteica per overexpress la proteina di interesse, e (3) small interfering RNA downregulate espressione genica. Manipolando il livello di espressione di particolari geni e misurando l'effetto differenziale di tali manipolazioni, i ricercatori possono dedurre le funzioni geniche nei sistemi biologici scelti. Non tutti i metodi di trasfezione forniscono la stessa efficienza di trasfezione, e anche lo stesso metodo di tra....
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Protocollo
1. plasmide DNA Purification
- Estrarre DNA plasmidico utilizzando un kit maxiprep secondo il protocollo del produttore. Risospendere plasmide DNA in 500 ml di tampone TE.
- Eseguire un fenolo: cloroformio: estrazione di alcool isoamilico e isopropanolo precipitazioni per rimuovere i contaminanti batterici residue. La presenza di LPS interferisce con trasfezione 9.
- Aggiungere 500 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1, pH 8) al DNA plasmide e agitare energicamente per 15 sec. Fenolo provoca gravi ustioni cutanee ed è un anestetico così ustioni non sono sempre sentito fino a quando vi è un danno grave. Eseguire fen....
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Risultati
Figura 1 confronta l'efficienza di trasfezione dei due reagenti di trasfezione in RAW264.7. Il reagente a base lipidica tipicamente dato circa il 25% tasso trasfezione mentre la trasfezione basata poliammina-proteina / portato in circa il 5% di efficienza (Figura 1A). La differenza in termini di efficienza di trasfezione è stata anche osservata in segnali luciferasi in cellule RAW264.7 trasfettate con il promotore giornalista pGL3-IκBζ (Figura 1B). L'aggiunta di.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto non si concentra esclusivamente sulla efficienza di trasfezione, ma ha lo scopo di trovare un equilibrio tra efficienza e la conservazione degli stati fisiologici delle cellule. In particolare, la nostra procedura riesce a ridurre al minimo la tossicità di reagente di trasfezione e massimizzare il segnale luciferasi.
Un passo critico nel protocollo è la salute delle cellule. Culture Overgrown non sono adatti per la trasfezione come loro cambiamenti fisiologia e co.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione del Canadian Institutes for Health Research (CIHR). STC è titolare di un premio di dottorato per la ricerca dal CIHR e dalla Michael Smith Foundation. EYS è titolare di una borsa di studio CIHR. Il programma di formazione sui trapianti del CIHR ha anche fornito borse di studio per laureati a STC, EYS e SS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit PureLink HiPure Plasmid Maxiprep | Life Technologies | K210007 | Qualsiasi kit maxiprep funzionerà |
| Fenolo: cloroformio: alcol isoamilico | Life Technologies | 15593-049 | Grado di biologia molecolare. Il fenolo è tossico, quindi lavorare nella cappa aspirante, se possibile. Utilizzare lo strato organico trasparente inferiore se nel contenitore si formano due strati di liquido. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso. |
| Siero fetale bovino | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inattivato a 56 gradi C bagnomaria per 45 minuti prima dell'uso. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Riscaldare almeno a temperatura ambiente prima dell'uso. |
| Reagente di trasfezione XtremeGene HP DBA | Roche | 6366236001 | Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. |
| 5x tampone per lisi passiva | Promega | E1941 | 30 ml è incluso nel sistema di analisi Dual Luciferase |
| Reporter Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
Riferimenti
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T.
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Ristampe e permessi
