Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.
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Articolo metodologico
Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Grazie alla loro modularità e alla capacità di essere riprogrammati per riconoscere un'ampia gamma di sequenze di DNA, i domini di legame al DNA Cys2-His 2 a dita di zinco sono emersi come strumenti utili per l'ingegneria genomica mirata. Come molte altre proteine che legano il DNA, anche le dita di zinco possiedono la capacità innata di attraversare le membrane cellulari. Recentemente abbiamo dimostrato che questa permeabilità cellulare intrinseca potrebbe essere sfruttata per il rilascio intracellulare di proteine. La fusione genetica di motivi a dita di zinco porta a un trasporto efficiente di carichi di proteine ed enzimi in un'ampia gamma di tipi di cellule di mammifero. A differenza di altre tecnologie di trasduzione delle proteine, la somministrazione tramite domini a dita di zinco non inibisce l'attività enzimatica e porta ad alti livelli di consegna citosolica. Qui viene presentato un protocollo dettagliato passo dopo passo per l'implementazione della tecnologia a dita di zinco per la somministrazione di proteine nelle cellule di mammifero. Vengono evidenziati i passaggi chiave per raggiungere alti livelli di somministrazione intracellulare mediata da dita di zinco e vengono discusse le strategie per massimizzare le prestazioni di questo sistema.
Introduzione
Altamente strategie consegna proteine efficienti e versatili sono fondamentali per molti la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. La consegna diretta di proteine purificate in cellule rappresenta uno dei metodi più sicuri e più semplici per raggiungere questo. 1,2 differenza strategie che si basano su espressione genica da acidi nucleici, proteine 3-5 consegna non comporta alcun rischio di mutagenesi inserzionale, è indipendente dal cellular trascrizione macchinari e / definizione permette un effetto immediato. Tuttavia, la mancanza di metodi semplici e generalizzabili per dotare l'attività delle cellule-penetrante su proteine ....
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Protocollo
1. Clonazione
- Ottenere domini Zif due dita alanina-sostituiti che sono stati sub-clonati nel sistema vettore di espressione pET-28 e sono disponibili su richiesta (PET-2F-ZIF). 34
- PCR amplifica EmGFP dal plasmide Emerald-pBAD con primer 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma sito ho in grassetto) e 3 'SacI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sac sito che ho in grassetto).
- Utilizzare 5 ng di DNA stampo, 10 microlitri di tampone 10x polimerasi, 1 unità (U) di DNA polimerasi Taq, 0,2 mM ciascun dNTP e....
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Risultati
Due dita proteine di fusione Zif-EmGFP possono essere espressi in E. coli con> 95% omogeneità e rese elevate (> 25 mg / ml) (Figura 2). In generale, a uno o due dita proteine di fusione ZIF possono essere prodotti in quantità quasi identiche a quelle del wild-type di proteine non modificato. Tuttavia, in alcuni contesti, proteine di fusione ZIF cinque e sei dita sono in grado di essere prodotti in rendimenti abbastanza elevati per applicazioni a valle.
.......
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Discussione
Qui, un protocollo di step-by-step per la consegna delle proteine usando zinc-finger (ZIF) domini cellulari permeabili è presentato. Il dominio ZIF non riduce l'attività del fuso carico enzimatica 34; consente la produzione e purificazione di proteine dei rendimenti quasi identici a quelli osservati con proteine non modificato; e può trasportare proteine ed enzimi in una vasta gamma di tipi di cellule con efficienze superiori peptide o proteina sistemi tradizionali dominio trasduzione cellula-pene.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (DP1CA174426 di Carlos F. Barbas) e ShanghaiTech University di Shanghai, in Cina (a JL). Grafici molecolari sono stati generati utilizzando PyMol.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Espandi il sistema PCR ad alta fedeltà | Roche | 11759078001 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini gel proteici, 1,5 mm, 10 pozzetti Life | Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Campione Tampone | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligasi | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competente E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Cloruro di zinco | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamicina solfato | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Cloruro di Sodio | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Resina di agarosio | QIAGEN | 30210 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Unità di filtro centrifughe | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Tecnologie di vita | del siero fetale bovino | 10437-028 | |
| Antibiotico-antimicotico | Life Technologies | 15240-062 | |
| Piastra a fondo piatto a 24 pozzetti | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poli-lisina | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Life Technologies | 21600010 | |
| Eparan solfato | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | ||
| celle HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spettrofotometro | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR | QIAGEN | 28104 | |
| Kit di estrazione del gel QIAquick | QIAGEN | 28704 |
Riferimenti
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol....
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Ristampe e permessi
