Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys ₂ -Il suo ₂ domini zinc-finger

Altamente strategie consegna proteine ​​efficienti e versatili sono fondamentali per molti la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. La consegna diretta di proteine ​​purificate in cellule rappresenta uno dei metodi più sicuri e più semplici per raggiungere questo. ^1,2 differenza strategie che si basano su espressione genica da acidi nucleici, proteine ^​​3-5 consegna non comporta alcun rischio di mutagenesi inserzionale, è indipendente dal cellular trascrizione macchinari e / definizione permette un effetto immediato. Tuttavia, la mancanza di metodi semplici e generalizzabili per dotare l'attività delle cellule-penetrante su proteine ​​confonde regolarmente il loro ingresso diretto nelle cellule. Gli attuali metodi per facilitare la consegna proteina intracellulare si basano sull'uso di naturalmente ^6-8 o progettati peptidi cellula-penetranti, ^9-12 domini di trasduzione sovralimentati, ^13,14 nanoparticelle ¹⁵ e liposomi, ¹⁶ particelle simili al virus ^17,18 19 Purtroppo, molti di questi approcci sono ostacolati da bassi tassi di assorbimento cellulare, ^20,21 scarsa stabilità, ²² involontaria tipo cellulare specificità, ²³ basso endosomali proprietà di fuga ^{di 24} e la tossicità. ²⁵ Inoltre, molti proteine ​​e tecnologie di trasduzione riducono la bioattività delle proteine ​​consegnati. ¹⁴

Il nostro laboratorio in precedenza dimostrato che zinc-finger nucleasi (ZFN) proteine ​​- restrizione endonucleasi chimerico costituito da una Cys ₂ -Il suo ₂ zinc-finger proteina-DNA-binding programmabile e il dominio scissione del FokI endonucleasi di restrizione ^26-28 - sono intrinsecamente cell- permeabile. ²⁹ L'attività delle cellule-penetrante sorprendente ha dimostrato di essere una proprietà intrinseca del dominio zinc-finger design personalizzato, una piattaforma di legame al DNA che è emersa come un potente strumento per la mirata del genoma enEngineering, ^30-32 e considerato il risultato della costellazione di sei residui carichi positivamente sulla superficie della proteina. Infatti, diverse proteine ​​che legano il DNA, tra cui c-Jun e N-DEK hanno dimostrato di possedere una capacità innata di attraversare le membrane cellulari. ³³ Più recentemente, il nostro laboratorio espanso su questi risultati e dimostrato che l'attività delle cellule-penetrante di zinco finger (ZIF) domini potrebbero essere sfruttate per la consegna delle proteine ​​intracellulari. La fusione genetica di entrambi i domini ZIF uno o due dita per uno specifico carico di proteine ​​portato ad assorbimento di efficienza che hanno superato molti sistemi di consegna di peptidi cellula-penetranti convenzionali. ³⁴ In particolare, la consegna Zif-mediata non ha compromesso l'attività di carico enzimatica fuso e facilitato alti livelli di consegna citosolico. Collettivamente, questi risultati dimostrano il potenziale del dominio ZIF per facilitare la consegna efficiente e facile delle proteine, e potenzialmente più diversi tipi di macromolecole, nelle cellule.

Qui, un protocollo dettagliato passo-passo su come implementare la tecnologia ZIF per la consegna delle proteine ​​in cellule di mammifero è presentato. Abbiamo già costruito una suite di uno, due, tre, quattro, cinque e sei dita domini ZIF che non hanno la capacità di legare il DNA, a causa della sostituzione di ciascuno dei DNA-binding residui α-elica, ma sono in grado di fornire proteine ​​in cellule ³⁴ (Figura 1). La produzione e la trasduzione di Emerald GFP (EmGFP) in cellule HeLa utilizzando una Zif dominio a due dita è descritto. Questo protocollo è estensibile a quasi qualsiasi proteina in grado di espressione solubile in Escherichia coli e quasi ogni tipo di cellula di mammifero. I risultati attesi sono forniti e strategie per massimizzare le prestazioni di questo sistema vengono anche discussi.

1. Clonazione

1. Ottenere domini Zif due dita alanina-sostituiti che sono stati sub-clonati nel sistema vettore di espressione pET-28 e sono disponibili su richiesta (PET-2F-ZIF). ³⁴
2. PCR amplifica EmGFP dal plasmide Emerald-pBAD con primer 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma sito ho in grassetto) e 3 'SacI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sac sito che ho in grassetto).
   1. Utilizzare 5 ng di DNA stampo, 10 microlitri di tampone 10x polimerasi, 1 unità (U) di DNA polimerasi Taq, 0,2 mM ciascun dNTP e 0,2 mM di ciascun primer in una soluzione di 100 microlitri con il volume rimanente costituiti di acqua distillata / deionizzata . Utilizzare le condizioni di ciclismo: 95 ° C per 5 minuti; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 10 min. Purificare il prodotto PCR gel extraction e determinare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro misura Abs ₂₆₀ x 50 ug / ml.
3. Digest pET-2F-ZIF e l'inserto codifica EmGFP con gli enzimi di restrizione Xma I e Sac I in tampone raccomandato per 3 ore a 37 ° C utilizzando 10 U di enzima per 1 mg di DNA. Visualizza DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio utilizzando un colorante fluorescente intercalante, come bromuro di etidio.
4. Purificare il DNA digerito dalla kit estrazione gel e determinare la concentrazione di DNA da uno spettrofotometro misurando Abs ₂₆₀ x 50 mg / ml.
5. Legare il DNA EmGFP-codifica purificato in 50-100 ng di PET-2F-ZIF con 1 U di T4 DNA Ligase per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Per ottenere i migliori risultati, effettuare la reazione di ligazione utilizzando un 6: rapporto molare 1 inserto a vettoriale.
6. Scongelare 50 ml di eventuali chimicamente competenti XL-1 blu Escherichia coli su ghiaccio e mescolare delicatamente con 10-20 ng di legatura PET-2F-ZIF-EmGFP.
7. Tenere in ghiaccio per 30 min. Urti Riscaldare la miscela a 42 ° C per 90 sec e recuperare le cellule in 2 ml di brodo con Super Optimal Cataboliti rimozione (SOC) per 1 ora a 37 ° C con agitazione.
8. Stendere 100 ml di cultura recupero su un brodo lisogenia (LB) piastra di agar con 50 mg / ml kanamicina e incubare O / N a 37 ° C.
9. Il giorno seguente, inoculare 6 ml di Super Broth (SB) o di coltura LB contenente 50 ug / ml kanamicina con una colonia dalla piastra di agar LB e cultura O / N a 37 ° C.
   Nota: Colony PCR utilizzando i primer 5 'XmaI-EmGFP e 3' SacI-EmGFP potrebbe essere utilizzata per identificare cloni positivi prima miniprep.
10. Purificare pET-2F-ZIF-EmGFP da miniprep e confermare plasmide dal sequenziamento del DNA utilizzando promotore T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Espressione e purificazione

1. Scongelare 50 ml di chimicamente competente BL21 E. coli su ghiaccio e mescolare delicatamente con 100 ng di PET-2F-ZIF-EmGFP plasmid. Trasforma come descritto nei passaggi 1,7-1,8.
2. Il giorno seguente, inoculare 10 ml di terreno LB contenente 50 mg / ml kanamicina con una singola colonia e crescere O / N a 37 ° C con agitazione.
3. Il giorno seguente, diluire i 10 ml di O / N cultura in 1 l di terreno LB integrata con 50 mg / ml kanamicina, 0,2% di glucosio e 100 micron ZnCl _2. Crescere la coltura a 37 ° C con agitazione ad una densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ di 0,8 e indurre l'espressione di proteine ​​con 2 mM isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Dopo 6 ore di crescita a 37 ° C, le cellule raccolto per centrifugazione a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C.
   Nota: Le condizioni induzione sono molto variabili e dipendono dalla stabilità delle proteine ​​espressi. Monitorare l'OD ₆₀₀ ogni 30 minuti fino a quando un OD ₆₀₀ di 0,8 è raggiunto.
4. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl _2, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM MgCl _2, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e imidazolo 10 mM, pH 8,0). Lisare le cellule sul ghiaccio di ultrasuoni con la seguente impostazione: uscita di potenza del 50%, 4 min di tempo di processo con 5 sec su / 10 sec off intervalli. Evitare il surriscaldamento della soluzione.
5. Centrifugare il lisato cellulare a 25.000 xg per 30 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una provetta di raccolta fresco. Per ottenere i migliori risultati, eseguire le seguenti operazioni a 4 ° C.
6. Eseguire il surnatante con una colonna pre-compresso con 1 ml di equilibrata liquami Ni-NTA. Lavare la resina con 20 ml di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl _2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl ₂ e imidazolo 30 mM, pH 8,0).
7. Eluire la proteina con 5 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl _2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl _2, e imidazolo 300 mM, pH 8,0).
8. Buffer scambiare la proteina eluita con tampone di stoccaggio (50 mMTris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl _2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl ₂ e 10% glicerolo, pH 8,0) e concentrare la proteina di almeno 40 mM usando un concentratore rotazione mediante centrifugazione secondo le istruzioni del produttore.
9. Determinare la concentrazione di proteine ​​da BCA o saggio Bradford. Mescolare 2 ml di proteine ​​purificate con 2 ml 2 × SDS-PAGE loading dye, ebollizione a 95 ° C per 10 minuti e poi risolvere il 4% -20% Tris-Glycine SDS-PAGE per valutare la proteina purezza (Figura 2).

3. Protein bagagli

1. Aliquota la proteina concentrata, flash congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Per proteine ​​di fusione EmGFP, coprire il tubo con un foglio di alluminio per proteggere la proteina dalla luce.
2. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti della soluzione proteica. Nota: le proteine ​​Zif-fuse sono stabili in queste condizioni per almeno 1 mese. O> 4 stoccaggio inappropriato mese può portarealle proteine ​​precipitazione o photobleaching di EmGFP.

4. proteina di trasduzione

1. Mantenere cellule HeLa in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotico-antimicotico a 37 ° C in un ambiente completamente umidificata con 5% di CO _2.
   Nota: Le celle diversi passaggi più di 30 volte non sono raccomandati per la proteina di trasduzione.
2. Pre-coat una piastra a 24 pozzetti con 500 ml di 50 mg / ml di poli-lisina per 30 a 60 minuti a 25 ° C. Cellule Seed su una piastra da 24 pozzetti ad una densità di 2 x 10 ⁵ cellule per pozzetto. A 24 ore dopo la semina, o una volta cellule sono tra l'80% -90% confluenti, rimuovere i supporti da ciascun pozzetto e lavare con 500 ml di pre-riscaldato DMEM senza siero (SFM).
3. Per ogni bene, aggiungere 250 ml di SFM contenente 2 mM di proteine ​​Zif-EmGFP e 100 micron ZnCl _2. Incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora. Nota: i domini ZIF entrano nelle cellule primarily attraverso macropinocitosi, ³⁴ che è un meccanismo di energia-dipendente. Pertanto, le cellule devono essere incubate a 37 ° C per un efficiente internalizzazione proteine.
4. Rimuovere supporti dalle cellule e lavare tre volte con 500 ml di calcio-magnesio e senza tampone fosfato salino di Dulbecco (DPBS) supplementato con 0,5 mg / ml di eparina. Nota: L'eparina è necessario rimuovere legato alle proteine ​​di superficie che potrebbe complicare le analisi a valle.
5. (Opzionale) Ripetere i trattamenti fino a tre volte per la consegna maggiore.
6. Isolare cellule trattate immediatamente dopo eparina lavaggio mediante digestione con 0,05% tripsina-EDTA a 37 ° C per 2 min. Risospendere le cellule staccate in 0,5 ml di DPBS addizionato con 1% FBS.
7. Misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun campione mediante citometria di flusso ³⁵ utilizzando il canale di isotiocianato di fluoresceina (FITC) (Figura 3). Regolare il forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) per posizionare la popolazioneinteressi su scala, assicurando che le popolazioni con proprietà differenti vengono risolte tra loro.
8. Raccogliere 10.000 eventi live per ogni campione e analizzare i dati in citometria a flusso di analisi dei dati del software. ³⁶ Normalizzare fluorescenza da cellule HeLa trattate con ZIF EmGFP a quelle cellule trattate solo con SFM.

Due dita proteine ​​di fusione Zif-EmGFP possono essere espressi in E. coli con> 95% omogeneità e rese elevate (> 25 mg / ml) (Figura 2). In generale, a uno o due dita proteine ​​di fusione ZIF possono essere prodotti in quantità quasi identiche a quelle del wild-type di proteine ​​non modificato. Tuttavia, in alcuni contesti, proteine ​​di fusione ZIF cinque e sei dita sono in grado di essere prodotti in rendimenti abbastanza elevati per applicazioni a valle.

Applicazione diretta di due dita proteina ZIF-EmGFP su cellule HeLa per 90 min a 37 ° C comporta un aumento dose-dipendente della EmGFP fluorescenza (Figura 3A). Critico, nessuna fluorescenza è osservata in assenza del dominio ZIF. Abbiamo già osservato che quasi il 100% delle cellule sono fluorescenti dopo il trattamento con il solo 2 mM di due dita della proteina Zif-EmGFP, e che le cellule HeLa trattate con proteine ​​di fusione ZIF sono positivi per EmGFP fluorescenza a concentrazioni di proteine a partire da 0,25 micron (Figura 3B).

Figura 1. Struttura e sequenza delle proteine ​​zinc-finger. Struttura (Top) Cristallo di un singolo dominio zinc-finger (ZIF). Le catene laterali della Cys conservati e suoi residui coordinati con il Zn 2+ ioni sono mostrati come bastoni (PDB ID: 2I13). 37 (in basso) Sequenza del dominio ZIF. Frecce e cilindri indicano Β fogli e α-elica strutture secondarie, rispettivamente. I DNA-binding residui α-elica che sono stati sostituiti con alanina sono evidenziati rosa. Residui carica positiva previsti per mediare internalizzazione cellulare sono evidenziate azzurro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Zif-mediata consegna di proteine ​​in cellule HeLa. (A) fluorescenza intensità di cellule HeLa trattate con quantità crescenti di due dita della proteina ZIF-EmGFP. Cellule HeLa trattate con proteine ​​EmGFP solo sovrappongono interamente con cellule non trattate. (B) normalizzato intensità di fluorescenza delle cellule HeLa trattate consecutivamente con 2 micron of due dita proteine ​​ZIF-EmGFP. Intensità fluorescenza è stata determinata mediante citometria a flusso.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.