Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

Sommario

Abbiamo stabilito un metodo per incapsulare cellule staminali pluripotenti (cellule PS) in capsule di idrogel di alginato utilizzando un ugello coassiale. Ciò impedisce alle cellule di aggregarsi eccessivamente e limita lo stress da taglio sperimentato dalle cellule in coltura in sospensione. La tecnica è applicabile alla produzione di massa di cellule PS e alla ricerca sulla nicchia delle cellule staminali.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti (cellule PS) sono al centro di un'intensa ricerca grazie al loro ruolo nella medicina rigenerativa e nello screening dei farmaci. Tuttavia, lo sviluppo di un sistema di coltura di massa sarebbe necessario per l'utilizzo delle cellule PS in queste applicazioni. La coltura in sospensione è un metodo di coltura promettente per la produzione di massa di cellule PS, anche se alcuni problemi come il controllo dell'aggregazione e la limitazione dello stress di taglio dal terreno di coltura sono ancora irrisolti. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo di incapsulamento dell'alginato di calcio (Alg-Ca) utilizzando un ugello coassiale. Questo metodo può controllare facilmente le dimensioni delle capsule facendo fluire in confluenza il gas N₂. Il diametro della capsula controllabile deve essere maggiore di 500 μm perché una portata troppo elevata di gas N₂ provoca la rottura delle goccioline e quindi delle capsule di dimensioni eterogenee. Inoltre, una bassa concentrazione di Alg-Na e CaCl₂ provoca la formazione di capsule non sferiche. Sebbene una capsula di Alg-Ca senza un rivestimento di Alg-PLL si dissolva facilmente consentendo la raccolta di cellule, queste possono anche potenzialmente fuoriuscire da capsule prive di un rivestimento di Alg-PLL. In effetti, un rivestimento in alginato-PLL può prevenire la perdita cellulare ma è anche difficile da rompere. Questa tecnologia può essere utilizzata per la ricerca sulla nicchia delle cellule staminali e sulla produzione di massa di cellule PS perché l'incapsulamento può modificare il microambiente che circonda le cellule, compresa la matrice extracellulare e la concentrazione di fattori secreti.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti indotte (cellule iPS) sono attualmente fonte di intensa ricerca grazie al loro ruolo nella medicina rigenerativa. Tuttavia, sono necessarie enormi quantità di cellule per la rigenerazione dei tessuti. Ad esempio, circa un miliardo di cellule pancreatiche necessarie per un paziente diabetico di tipo 1¹. Tuttavia, la coltura convenzionale su piastra è in grado di ottenere solo 1 × 10⁵ cellule/cm², richiedendo quindi 1 m² di area di coltura per ottenere abbastanza cellule pancreatiche derivate da cellule staminali per trattare un paziente diabetico di tipo 1. Lo sviluppo di un sistema per la coltura di massa di cellule staminali pluripotenti, come il microcarrier² e la coltura in sospensione, è quindi necessario per la medicina rigenerativa. La coltura in sospensione rappresenta un metodo promettente di coltura di massa, ma il controllo dell'aggregazione delle cellule è difficile nelle colture in sospensione diretta di cellule iPS umane³. Infatti, le celle sospese sono esposte a sollecitazioni di taglio, che causano danni cellulari³ o differenziazione⁴.

Sono state condotte ricerche sull'incapsulamento a base di idrogel per risolvere i problemi associati alla coltura in sospensione. Nelle capsule di idrogel, le cellule sono protette dal flusso del mezzo. Rapporti precedenti hanno documentato l'uso di vari tipi di idrogel, tra cui agarosio⁵, PEG⁶ e alginato (Alg), per l'incapsulamento cellulare. L'idrogel di Alg-Ca è uno degli idrogel più utili per l'incapsulamento cellulare perché l'idrogel di Alg-Ca si forma immediatamente dopo aver versato la soluzione di alginato in una soluzione di CaCl₂ ed è anche prontamente digerito da enzimi o reagenti chelanti.

Qui, abbiamo stabilito un processo di incapsulamento stabile dell'alginato per le cellule iPS utilizzando un ugello coassiale. Utilizzando il flusso di gas N₂ per la formazione di goccioline, è possibile incapsulare le cellule in capsule uniformi senza la necessità di altri reagenti come l'olio. In questo metodo, la velocità di flusso di N₂ e la concentrazione sia di CaCl₂ che di alginato sono le principali condizioni operative che influenzano le dimensioni, la forma e l'uniformità delle capsule. Questo rapporto dimostra l'ottimizzazione di queste condizioni operative attraverso l'uso di una telecamera ad alta velocità e di un microscopio.

Protocollo

1. Materiali Preparazione

1. Preparare 10 tampone HEPES mM. Portare il pH a 7,0 a RT e aggiungere NaCl allo 0,9%.
2. Preparare la soluzione di alginato 5% e la soluzione di EDTA 10 mM mescolando salina tamponata HEPES preparato in 1.1. Portare il pH a 7,0 a RT.
3. Autoclave i reagenti (1.1, 1.2) per 20 minuti a 121 ° C.
4. Preparare 60 millimetri piatti di gelatina rivestite con strati 1,2-2,0 × 10 ⁶ topo fibroblasti embrionali (MEF), le cellule, che sono trattati come cellule di alimentazione mediante incubazione all'interno DMEM contenente 10% FBS ES-qualificati e 10 mg / ml di mitomicina C per 90 - 120 min.
5. Mantenere topo staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule sul piatto con le cellule di alimentazione in presenza di 5 ml di glucosio DMEM contenente il 20% di ES-qualificato FBS, 50 micron di 2-mercaptoetanolo, aminoacido non essenziale, e gli antibiotici ( 100 unità / ml di penicillina G sodio, 100 ug / ml di solfato di streptomicina, e 250 ng / ml di amphotericin B).
6. Seed 4 × 10 ⁵ cellule ips su 60 mm piatto gelatina rivestite e incubare a 37 ° C e 5% CO _2. Modificare il terreno di coltura ogni giorno durante l'incubazione. Dopo 3 - 4 giorni di coltura, trypsinize cellule per 1 min con 500 ml di 0,05% tripsina contenente 0,02% EDTA a 37 ° C e 5% CO _2. Dopo di che, staccare le cellule toccando il piatto cultura dieci volte.
7. Aggiungere 2,5 ml di DMEM con 10% di FBS e antibiotici ES-qualificato (seguenti cellule iPS topo dissociazione in cellule singole pipettando con 1.000 microlitri micropipetta tre volte) sospensione cellulare centrifugare a 160 g per 3 minuti e rimuovere il surnatante e contare le cellule . Dopo il conteggio delle cellule, reseed le cellule raccolte su un piatto di gelatina a polvere e incubare per 30 minuti per isolare le cellule iPS dalle cellule MEF. Dopo il conteggio delle cellule (di solito 1-3 × 10 ⁶ cellule / piatto può essere raccolto), reseed 4 × 10 ⁵ cellule iPS suil piatto.

2. Cella incapsulamento in alginato Hydrogel Capsule

1. Raccogliere le cellule con la stessa procedura descritta in 1.5 e 1.6. Dopo la centrifugazione a 160 g per 3 minuti, lavare il pellet di cellule iPS con soluzione salina HEPES-buffered tre volte. Dopo ri-sospensione le cellule in soluzione salina tamponata HEPES, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 40 micron cellula per rimuovere grandi aggregati, che potrebbero intasare l'ugello.
2. Mescolare 2 ml di sospensione cellulare all'interno di soluzione salina tamponata HEPES e 3 ml di soluzione al 5% Alg-Na. Infine 5 ml di sospensione cellulare entro il 3% soluzione Alg-Na si ottiene. Densità cellulare è vantaggiosamente maggiore di 10 ⁶ cellule / ml.
3. Dopo aver raccolto la sospensione cellulare in una siringa da 5 ml, installare un ugello coassiale (Figura 1A, B) sulla siringa e disporli su pompa a siringa. Emit N ₂ flusso di gas (inferiore 1L / min) attraverso l'ago esterna dell'ugello coassiali eespellere la sospensione cellulare attraverso l'ugello interno.
4. Raccogliere gocce in 250 ml di soluzione allo 0,5% di CaCl ₂ ed attendere 10 - 20 min per gelificazione mentre agitazione a 60-90 rpm.

3. Trattamento di alginato Capsule (opzionale)

1. Incubare capsule Alg-Ca a 0,05% (w / v) di poli-L-lisina (PLL) soluzione per 5 min a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Dopo aver lavato le capsule con soluzione salina tamponata con HEPES-, incubare in DMEM contenente 10% FBS per neutralizzare la carica elettrica sulla loro superficie. Utilizzare loro sotto forma di capsule rivestite (Figura 1C).
3. Incubare le capsule in soluzione salina tamponata HEPES contenente EDTA 10 mM per 5 min. Le capsule trattato con EDTA sono utilizzati sotto forma di capsule cavi (Figura 1C).

4. Cultura e raccogliere le cellule in alginato Capsule

1. Incubare le cellule incapsulate a 75 rpm con agitazione a 37 ° C e 5% CO ₂per 10 giorni.
2. Raccogliere e incubare le capsule EDTA 10 mM a 37 ° C e 5% CO ₂ per 10 min. Raccogliere le cellule dalle capsule alginato senza trattamento PLL per centrifugazione a 1000 g per 3 min.
3. Se capsule di alginato sono trattati con PLL, rompere la membrana Alg-PLL pipettando su e giù intorno dieci volte con un ago attaccato ad una siringa e centrifugare a 1000 - 5000 xg per 5 min. Diametro ago deve essere inferiore formato di capsule e 25 g (260 micron) aghi sono utilizzati in questo esperimento (600 micron)
4. Dopo la centrifugazione, raccogliere pellet cellulare rigorosamente da rotte membrane Alg-PLL, se si vuole raccogliere campioni di mRNA da cellule. Rimanenti membrane Alg-PLL eventualmente prevenire mRNA purificazione.

Risultati

Al protocollo 2.5, la soluzione di alginato espulso forma una forma sferica subito dopo l'espulsione (Figura 2A - H). Se la sospensione viene espulso con una portata N ₂ inferiore 1L / min, la dimensione delle goccioline è uniforme (figura 2I). Tuttavia, se il flusso di N ₂ è superiore a 1L / min, la goccia si rompe (figura 2G, a freccia bianca) e la dimensione delle goccioline diventa eterogenea (Figura 2J). Dato questo, è diffici...

Discussione

Cultura incapsulamento può essere confrontato con le culture diretti sospensione. Coltura in sospensione è un metodo semplice per ottenere grandi quantità di cellule staminali pluripotenti rispetto ai metodi di incapsulamento. Tuttavia, controllando l'aggregazione di cellule in coltura in sospensione è ancora impegnativo. Nel metodo di incapsulamento, aggregazione cellulare è limitata in capsule e può quindi essere ben controllata. Una pubblicazione precedente ha mostrato che le cellule incapsulate formano agg...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fibroblasto embrionale di topo	Cell Biolabs	SNL 76/7
Cellula staminale pluripotente indotta dal	topo RIKEN Bio centro di ricerca	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM ad alto glucosio	GIBCO	11995
ES qualificato  FBS	GIBCO	16141079
Antibiotici antibatterici	GIBCO	15240
Aminoacido non essenziale	GIBCO	11140
2-mercaptoetanolo	GIBCO	21985-023
ESGRO Fattore inibitorio della leucemia	Merck Millipore	ESG1107
Tripsina/EDTA	GIBCO	25300
Ago da 26 G/16 G	Hoshiseido
da 10 ml	TERUMO	SS-10ESZ
Sodio  Cloruro	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Alginato di sodio	Wako	194-09955
Cloruro di calcio	Wako	039-00475
Poli-L-lisina (MW = 15.000 - 30.000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Pompa Sylinge	AS ONE
Microscopio	Olympus	IX71
Microscopio	Leica	DM IRB
Fotocamera Hispeed	nac tecnologia di immagine	Memrecam HX-3