Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

I reni mantenere l'equilibrio omeostatico per varie sostanze e regolare il volume di sangue in un modo che determina la pressione totale di sangue. Disturbi della filtrazione renale, riassorbimento o secrezione causare o accompagnare stati patologici, che vanno da iper- o ipotensione per terminare malattia renale allo stadio che alla fine richiede il trapianto di rene. L'unità di filtrazione renale (glomerulo) consiste di tre strati - l'endotelio capillare, membrana basale e uno strato cella singola di cellule epiteliali - podociti, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità e della funzione ¹ fessura diaframma. Disfunzione nel filtro glomerulare permselective causa la perdita urinaria di macromolecole, come la proteinuria. Vari agenti possono influenzare la struttura dei podociti ei processi piede, che determinano l'integrità della barriera di filtrazione glomerulare.

I podociti sono coinvolti nel mantenimento della glomfunzione di filtrazione Eruli. È stato stabilito che la movimentazione calcio improprio dal podociti porta a danno cellulare e svolge un ruolo importante nella progressione di varie forme di nefropatie ^2,3. Pertanto, lo sviluppo di un modello che permette di misurazione diretta dei cambiamenti concentrazione intracellulare di calcio sarà determinante per lo studio della funzione podocita. Isolati glomeruli erano già stati utilizzati in numerosi studi, tra cui la misurazione del coefficiente di riflessione albumina cambia ⁴ e la valutazione delle correnti cellulari integrali nelle cellule intere elettrofisiologiche misurazioni patch-clamp ^5,6. Nel presente lavoro si descrive il protocollo che consente al ricercatore di misurare le variazioni della concentrazione di calcio intracellulare in risposta a richieste di agenti farmacologici, stimare i livelli basali di calcio all'interno delle cellule, e valutare l'attività canali del calcio individuale. Misure della concentrazione di calcio Ratometric e patch-clamp electrophysiology sono stati usati per determinare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio nell'ambito dell'attività podocita e il canale, rispettivamente.

Uso e benessere degli animali dovrebbero aderire alla guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio seguendo protocolli esaminato e approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC).

1. Rene Flush

1. Utilizzare da 8 a 12 settimane di età topo maschio (consigliato è un ceppo Sprague Dawley, ma altri ceppi di età e sesso diverso possono essere utilizzati con le opportune modifiche).
2. Anestetizzare l'animale secondo la procedura consentita dal protocollo IACUC; monitorare profondità dell'anestesia e controllare l'animale. La descrizione dettagliata della chirurgia da eseguire in 1,3-1,8 possono essere trovati in Ilatovskaya et al ^7.
3. Dopo anestesia corretta, posizionare l'animale su un tavolo operatorio temperatura controllata, fare una incisione mediana dell'addome (fino a 3 pollici di lunghezza), e scoprire la vena cava e l'aorta.
4. Inserire legatura intorno ai celiaci e mesenterica superiore arterie e gli addominaliaorta sopra di quelli; non legare.
5. Blunt sezionare l'aorta addominale al di sotto delle arterie renali, e mettere due legature attorno ad esso, ma non legare, quindi bloccare l'aorta sopra le legature e legare il filo inferiore.
6. Cateterizzarla l'aorta con un tubo di polietilene PE50 (collegato a una pompa a siringa riempita con PBS) sotto il morsetto e fissare il catetere con la seconda legatura; rimuovere il morsetto, accendere la pompa, e legare l'aorta e le arterie mesenterica con celiaci. Fare rapidamente incisione nella vena renale per alleviare la pressione.
7. Infondere l'aorta con PBS pre-raffreddata per 2 o 3 minuti ad una velocità di 6 ml / min.
8. Smettere di perfusione, accise e decapsulate ⁷ i reni, e metterli sul ghiaccio in soluzione PBS. Euthanize l'animale secondo il protocollo approvato da IACUC.

2. Isolamento del Topo glomeruli

1. Preparare 30 ml di soluzione fresca di 5% BSA in RPMI 1640.
2. Utilizzando una lama di rasoio e forbici,isolare la corteccia di entrambi i reni, e poi sminuzzare fino omogeneo. Questa procedura è stata descritta in precedenza ^7.
3. Spingere il tessuto tritato durante la fase precedente al setaccio in acciaio inossidabile 100 mesh (pre-imbevuto di 5% di BSA soluzione / RPMI) con una spatola. Raccogliere il flusso continuo e dalla forza di gravità consentono il flusso continuo di passare attraverso un setaccio di 140 mesh.
4. Filtrare il flow-through raccolti dalle maglie 140 setaccio con un vaglio da 200 pre-impregnato, scartare il filtrato, e lavare la parte superiore del vaglio a 10 - 15 ml della soluzione di BSA / RPMI preparati a raccogliere i glomeruli che sedimenti il setaccio.
5. Mettere la soluzione BSA / RPMI contenente glomeruli su ghiaccio in una provetta da 15 ml e lasciare il sedimento glomeruli sul fondo del tubo fino a 20 min. Il concentrato glomeruli sul fondo del tubo sarà visto chiaramente. Rimuovere la soluzione in eccesso, lasciando circa 2 ml nel tubo.

3. monocanale patch-clamp Electrophysiology

1. Preparare 5 x 5 mm frammenti di vetro di copertura da rivestimento con 70.000 MW - 150.000 poli-ʟ-lisina, e lasciare asciugare. Usare circa 30 ml di 0,01% sterile soluzione filtrata in acqua al vetro di copertura.
2. Riscaldare le soluzioni sperimentali RT e riempire la camera patch-clamp e pipetta. Per il monitoraggio canali TRPC, utilizzare una soluzione del bagno, in mm: 126 NaCl, 1 CaCl _2, 10 HEPES, 2 MgCl _2, 10 glucosio, pH 7.4; pipetta: 126 NaCl, 1,5 CaCl _2, 10 HEPES, 10 glucosio; pH 7.4.
   1. Aggiungere inibitori alla soluzione pipetta per bloccare l'attività di canali endogeni, che non sono rilevanti per gli studi (consigliate sono: 100 micron niflumico o DIDS (per bloccare Ca ²⁺ -activated Cl ^- canali), TEA 10 mm (per inibire la grande-conduttanza Ca ^{2 + -} K ⁺ dipendente canale), 10 nM iberiotoxin (per bloccare gli Ca ^{2 +} K ⁺ canali -activated), 10 mM nicardipina (per bloccare tipo N Ca²⁺ canali)) direttamente prima dell'esperimento patch-clamp.
3. Mescolare delicatamente la soluzione contenente glomeruli, e quindi applicare circa 50 ml di al coperchio rivestito chip di vetro poli-ʟ-lisina. Lasciate che i glomeruli attribuiscono per circa 5 minuti.
4. Spostare i chip di vetro con glomeruli alla camera di patch-clamp pre-riempite con la soluzione del bagno; profumato camera ad una velocità di 3 ml / min per 1 min per assicurare la rimozione dei glomeruli separati.
5. Condurre un esperimento patch-clamp convenzionale in una modalità cella-attached ^7. Con una pipetta di vetro (7 - 10 MW resistenza pipetta) formare una tenuta ad alta resistenza tra una pipetta e una membrana podocyte applicando aspirazione delicata (una pipetta collegata ad un podocyte sulla superficie del glomerulo isolato è mostrato in figura 2, sulla la sinistra).
6. Per le misure di cella-attached, passa-basso le correnti a 300 Hz da un filtro a otto poli Bessel.
7. Use isolata glomeruli in esperimenti di patch-clamp per un massimo di 4-6 ore. Mantenere la frazione magazzino glomeruli sul ghiaccio.

4. Raziometrico confocale misure di fluorescenza intracellulare concentrazione di calcio nelle podociti

1. Mettere 500 ml di frazione glomeruli (descritto in 2.5) a 0,5 ml tubo conico e aggiungere coloranti calcio Fura Red, AM e Fluo-4, AM. Utilizzare 2mM e 1 mm concentrazioni di stock di Fura Red, AM e Fluo-4, AM, rispettivamente (conservare a -20 ° C, sciolto in DMSO) e l'uso di 2,5 ml di ciascun colorante per 500 ml di frazione glomeruli. Immediatamente dopo l'aggiunta dei coloranti coprire il tubo con un foglio di alluminio.
2. Porre le provette su un agitatore rotante per almeno 20 minuti fino a 1 ora a temperatura ambiente.
   Nota: Agenti farmacologici possono essere aggiunti durante questa fase.
3. Preparare vetrini, coprirli con poli-ʟ-lisina e permettere l'asciugatura utilizzando set piatto riscaldato a 70 ° C.
4. Una volta che il carico di coloranti calcio è complete, applicare 100 ml di i glomeruli contenenti soluzione ai vetrini rivestiti di poli-ʟ-lisina e farli aderire alla superficie per circa 5 minuti. Montare i coprioggetti glomeruli-schiera in una camera di imaging, e profumato con la soluzione del bagno (contenente (in mM): 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl _2, 10 HEPES, pH 7,35) ad una velocità di 3 ml / min per rimuovere i glomeruli assegnata e le restanti coloranti.
5. Impostare il microscopio confocale a scansione laser ad una lunghezza d'onda di eccitazione 488 nm e filtri di emissione (525/25 e 650/25 nm per Fluo-4 e Fura Red, rispettivamente). Impostare il software di imaging per una frequenza e risoluzione desiderata.
6. Trovate i glomeruli in campo chiaro e poi accendere il rilevamento del segnale di fluorescenza. Regolare l'intensità del laser per ciascun colorante per evitare la saturazione del segnale. Scegliere il piano focale con podociti che sono direttamente collegati al vetro. Ciò minimizza l'effetto causato dalla contrazione di un glomerulo in risposta a farmaciapplicazione. Doppio controllo che glomerulo di scelta è ben attaccato al vetro;
7. Avviare l'imaging piano focale scelta (prendere 512 x 512 immagini con la frequenza impostata a 4 secondi per visualizzare Ca ²⁺ veloce cambiamenti transitori. Usare un 60X / NA 1.4 o simile lente dell'obiettivo immagine ad alta risoluzione per), si applicano le droghe di interesse, e registrare la risposta.
   1. Selezionare un piano focale desiderata (il più vicino alla superficie del vetro come possibile, per assicurare l'imaging di podociti sulla superficie del glomerulo). Controllare l'intensità della fluorescenza sul Fluo4 canali FuraRed, e assicurarsi che il glomerulo si vede chiaramente in campo chiaro.
   2. Inizia imaging. Prima dell'applicazione di qualsiasi droga, record di almeno 1 min di riferimento di fluorescenza per assicurarsi che il segnale è stabile (non ci sono picchi improvvisi o dissolvenza del segnale).
   3. Applicare farmaci desiderati con l'aiuto di una micropipetta; fare attenzione e verificare che il farmaco è stato in grado di diffondere bene e raggiungere il glomerUlus. Mescolare delicatamente la soluzione del bagno, se necessario, controllare il piano focale selezionata e verificare che non si muoveva fuori fuoco a causa della domanda di droga.
   4. Registrare i cambiamenti di intensità di fluorescenza per i segnali Fluo4 e FuraRed. Assicurarsi che la registrazione è abbastanza lungo, aspettando fino a quando il segnale raggiunge il livello di plateau o raggiunge un picco e poi ritorna al basale. Eseguire cambiamento soluzione o l'aggiunta di altri farmaci se necessario.
   5. Interrompere la registrazione, e salvare il file nel formato nativo del software.

5. Image Analysis per le Misure di calcio

1. Eseguire l'analisi delle immagini con il software ImageJ attrezzata con il plugin Utility ND che consente di importare le immagini nel formato ND2 nativo.
2. Importare la sequenza di immagini; assicurarsi di dividere i canali e utilizzare una modalità HyperStack scala di grigi.
3. Seguire la → Strumenti → ROI percorso Analizzare manager nel software ImageJ per openna un window manager ROI. Seleziona più regioni di interesse (podociti) utilizzando uno strumento di selezione ovale e il "(t) Aggiungi" funzione nel ROI Manager. Come l'ultimo ROI, selezionare l'area in background; salvare il ROI selezionate (More → Salva).
4. Evidenziare la finestra contenente il canale selezionato per le analisi. Utilizzare la More → funzione Multi Measure nella ROI Manager, selezionare la casella "una riga per ogni slice" nel dialogo che si apre, e quindi fare clic su OK. I risultati saranno mostrati nel formato che può essere impostato nella finestra dei risultati: entrare nei risultati opzione di menu → Set misurazioni, selezionare "Mean valore di grigio" e calcolare i valori di intensità dei pixel per ogni ROI, che verrà visualizzato nella finestra Risultati in colonne separate per ogni ROI.
5. Copiare i valori di intensità ROI misurati per ogni canale (Fluo-4 e Fura Red) nel comodo software di analisi dei dati; sottrazione di valori di intensità di fondo di ogni datun punto.
6. Per ogni punto di tempo calcolare il rapporto di intensità del Fluo-4 a canali Fura rossi. Trama scatter / linea point-tempo cambia di Ca ²⁺ transitoria per ogni ROI. Calcolare i valori medi / SE per glomeruli selezionati.
   Nota: colonna Ora deve essere impostato in base alla frequenza di imaging selezionato a 4.5.

6. intracellulari Calcoli calcio Concentrazione Uso Fluo-4 fluorescenza del segnale

1. Prelevare un campione dei glomeruli ed eseguire il protocollo sperimentale fino al punto 4.7. Dopo la registrazione della fluorescenza di fondo aggiungere Ionomicina (concentrazione finale nella camera vasca dovrebbe essere 10 pM) per la soluzione del bagno, e aumento dell'intensità di fluorescenza registrare. Una volta che l'intensità raggiunge il suo massimo e il decadimento comincia, aggiungere MnCl ₂ (concentrazione finale dovrebbe essere 5 mM) per estinguere la fluorescenza ^8.
2. Analizzare i dati ottenuti in 6.1. Copiare il Fluo-4 valori di intensità di segnale ROI ottenuti secondoil protocollo descritto a 5,1-5,5 da software di analisi preferito.
3. Calcolare la concentrazione di calcio intracellulare (in nm) nella podocita corrispondente alla ROI utilizzando una formula:
   
   dove K _d è una dissociazione predeterminato costante Fluo-4 (345 nM), F è l'intensità alla prima rilevazione che si sta calcolando la concentrazione di calcio per (basale) e F _min e F _max sono i valori di intensità del punto di carico massimo calcio (dopo l'applicazione ionomicina) e dopo quenching della fluorescenza (con MnCl _2), rispettivamente (vedere Figura 3).

Qui abbiamo affrontato il problema di misurare variazioni acute dei livelli di calcio nei podociti. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo sperimentale progettata per eseguire alta risoluzione confocale a fluorescenza diretta di imaging e singole registrazioni attività del canale ionico in podociti del fresco isolati glomeruli roditori. In breve, dopo che il ratto è anestetizzato, i reni devono essere lavati con PBS per eliminarli del sangue. Poi, i reni vengono escissi e decapsulated e glomeruli sono isolati dalla corteccia renale da setacciatura differenziale. Una parte del campione può essere preso per l'analisi patch-clamp e il resto può essere caricato con coloranti calcio fluorescente Fluo-4, AM e Fura Red, AM per eseguire confocale calcio raziometrici.

Misurazioni elettrofisiologiche delle singole attività del canale ionico può essere eseguita subito dopo l'isolamento dei glomeruli. Attività di ione channels può essere misurata sia in configurazioni cellulari-collegata e cellule intere del metodo patch-clamp. Per dimostrare la fattibilità del metodo illustrato è la registrazione del singolo ione calcio conducendo canale attività TRPC-like (Figura 2). Inoltre, è possibile applicare cella permeabile o-recettoriale farmaci per testare i loro effetti sul flusso di calcio in podociti a livello dei singoli canali ionici.

Un approccio che consente di valutare l'attività del canale singolo ione produce una varietà di dati che possono caratterizzare la funzione podocita. Tuttavia, può essere notevolmente completato misurando le variazioni della concentrazione di calcio a livello delle cellule intere. Per eseguire tali studi, glomeruli appena isolate sono stati caricati con coloranti fluorescenti per la microscopia confocale throughput elevato. Con una risoluzione ottica è possibile monitorare i livelli di calcio in diversi podociti alla volta. La figura 3 dimostra il tempo-Naturalmente per l'esperimento tipico di valutare le variazioni di concentrazione di calcio nel podociti. La concentrazione di calcio basale ai podociti è stata valutata sulla base della Fluo-4 fluorescenza. Dopo aver registrato l'intensità del segnale basale per 1 min (F), Ionomicina viene applicata e provoca la fluorescenza massima (Fmax) da raggiungere, che viene poi raffreddata da MnCl 2 (F min si nota). Secondo la formula 6.3, intensità di Fluo-4 segnale in ogni punto temporale dell'esperimento può essere poi tradotto nella concentrazione effettiva degli ioni calcio nella cellula. Come si vede dal grafico, significa fluorescenza in background (circa 400 unità arbitrarie) si traduce in 140 Nm, che è all'interno di un range di normalità di concentrazione per il calcio intracellulare in cellule non apoptotiche sani.

L'importanza e l'utilità di un approccio descritto è giustificata da un'altra applicazione, che permette di misurare transie calcio acutanti in podociti in risposta a vari farmaci. Figura 4A illustra immagini rappresentative del glomerulo ratto macchiato con Fluo-4 e Fura Red nella soluzione contenente calcio 2 mM (descritto in 4.5) prima e dopo aggiunta di 10 micron ATP. Nota un drammatico aumento del verde (Fluo-4 AM) fluorescenza delle podociti (contrassegnati con frecce), e un calo di Fura Red fluorescenza (pseudocolore rosso). Fluo4 e FuraRed riflettono un aumento della concentrazione di calcio ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm in modo opposto cioè, quando la concentrazione di calcio all'interno della cellula aumenta Fluo 4 intensità sale, mentre FuraRed scende. Questo è possibile grazie al duplice eccitazione natura FuraRed fluoroforo. A seconda della lunghezza d'onda di eccitazione può comportarsi come il calcio-bound (420 nm) o priva di calcio (488 nm) fluoroforo con corrispondente aumento o diminuzione della fluorescenza. Pertanto, è possibile l'utilizzo di FuraRed da solo in una modalità di imaging raziometrico, tuttavia requires due lunghezze d'onda di eccitazione - 420 nm e 488 nm. Ciò farà diminuire la frequenza dell'imaging almeno due volte (rispetto all'utilizzo di una eccitazione lunghezza d'onda); se il ricercatore vorrebbe tenere il ritmo veloce delle immagini, la risoluzione delle immagini deve essere ridotta. Tuttavia, Fluo 4 e FuraRed possono essere usati insieme in una modalità raziometrica senza perdita di risoluzione o diminuzione della frequenza di imaging, come questi fluorofori possono essere eccitati dalla stessa 488 nm laser, e forniscono una buona differenziazione degli spettri di emissione. Un transitorio tipico sintetizzato dalle ROI contrassegnati da frecce in figura 4A è mostrato nella Figura 4B; il grafico mostra chiaramente un aumento acuto / FuraRed rapporto di intensità Fluo4 dopo aggiunta di 10 mM ATP, che decade in pochi minuti. Le immagini sono state prese ogni 4 secondi, e quindi, la tecnica permette osservando rapidi cambiamenti nella concentrazione di calcio all'interno della cellula.

Figura 2. registrazione rappresentativa che mostra l'attività dei canali TRPC calcio nel podociti del ratto glomeruli appena isolato. Pannello sinistro dimostra la pipetta patch-clamp attaccato al corpo podociti sulla superficie del glomerulo durante una registrazione elettrofisiologica in configurazione cell-attached; una parte di un glomerulo incapsulato può essere visto in basso a destra dell'immagine. Rappresentante di traccia corrente dei canali dell'attività TRPC-simili da una toppa cella-attached fatta sulla podociti del glomerulo ratto a un potenziale tiene -40 mV è mostrata sulla destra. Il ce O indicano livelli di canali aperti e chiusi, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Rappresentante esperimento progettato per valutare il livello di calcio intracellulare in podociti. Per misurare la concentrazione di calcio intracellulare, glomeruli sono caricati con Fluo-4, AM, intensità di fluorescenza viene registrata nella linea di base e dopo l'aggiunta di ionomicina e MnCl 2. Il grafico mostra le variazioni del segnale di fluorescenza in risposta a ionomicina (produrre il massimo della Fluo-4 fluorescenza, F max) e MnCl 2, che spegne il colorante e determina l'intensità di fluorescenza più basso (F min). Intensità di fluorescenza (ascissa sinistra) per ciascun punto di tempo può essere tradotto nella concentrazione effettiva di calcio in nanomoli (destra ascissa) secondo la formula in 6.3. Si notino le inserti con immagini che mostrano podocytes nei punti di tempo in cui F, F max e min F sono stati calcolati. Il grafico riportato qui riflette intensità di fluorescenza del podocita contrassegnato da un cerchio (ROI); le immagini sono state scattate ogni 4 secondi.nk "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Misura dei transienti di calcio in podociti in risposta ad ATP. (A) Immagini rappresentative che illustrano il selvaggio glomerulo tipo ratto macchiato con Fluo-4 (pseudocolore verde) e Fura Red (pseudocolore rosso) nella soluzione contenenti calcio 2 mm prima e dopo l'aggiunta di 10 mM ATP. Bassa intensità di fluorescenza di colore verde prima dell'applicazione del farmaco va notato. (B) ha riassunto esempio del transitorio calcio intracellulare evocato podocytes mediante l'applicazione di 10 micron ATP. Nota una crescita forte e veloce in rapporto di intensità di fluorescenza Fluo-4 / Fura Red seguente aggiunta del farmaco, che rappresenta per la stimolazione e l'esaurimento del deposito di calcio e afflusso di calcio da the fuori della cellula, con conseguente aumento della concentrazione di calcio intracellulare. Le barre di errore rappresentano l'errore standard di mezzi calcolato per 11 podocytes dello stesso glomerulo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.