Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

Daria V. Ilatovskaya; Oleg Palygin; Vladislav Levchenko; Alexander Staruschenko

doi:10.3791/52850

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

10.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/52850

⸱

27 giugno 2015

Daria V. Ilatovskaya¹ , Oleg Palygin¹ , Vladislav Levchenko¹ , Alexander Staruschenko¹

¹Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

I cambiamenti nei livelli intracellulari di calcio nei podociti sono uno dei mezzi più importanti per controllare la funzione di filtrazione dei glomeruli. Qui spieghiamo un approccio ad alto rendimento che consente di rilevare in tempo reale la manipolazione del calcio e l'attività dei singoli canali ionici nei podociti dei glomeruli appena isolati.

Abstract

I podociti (cellule epiteliali glomerulari renali) sono noti per regolare la permeabilità glomerulare e mantenere la struttura glomerulare; un ruolo chiave per queste cellule nella patogenesi di varie malattie renali è stato stabilito poiché il danno dei podociti porta alla proteinuria e all'eliminazione del processo del piede. In precedenza è stato riportato che vari agenti endogeni possono causare un drammatico sovraccarico della concentrazione intracellulare di Ca²⁺nei podociti, presumibilmente portando all'albuminuria, e questo probabilmente avviene attraverso i canali ionici conduttori di calcio. Pertanto, è apparso importante studiare la manipolazione del calcio nei podociti sia in condizioni normali che in vari stati patologici. Tuttavia, gli approcci sperimentali disponibili sono rimasti in qualche modo limitati alle cellule in coltura e trasfettate. Sebbene rappresentino un buon modello di base per tali studi, sono essenzialmente estratti dall'ambiente nativo del glomerulo. Qui descriviamo la metodologia di studio dei podociti come parte del glomerulo intero appena isolato. Questo preparato conserva il potenziale funzionale dei podociti, che sono ancora attaccati ai capillari; Pertanto, i podociti rimangono nell'ambiente che conserva le parti principali dell'apparato di filtrazione dei glomeruli. Il presente manoscritto elabora due approcci sperimentali che consentono 1) la rilevazione in tempo reale delle variazioni di concentrazione di calcio con l'aiuto della microscopia raziometrica a fluorescenza confocale, e 2) la registrazione dell'attività dei singoli canali ionici nei podociti dei glomeruli appena isolati. Queste metodologie utilizzano i vantaggi dell'ambiente nativo del glomerulo che consentono ai ricercatori di risolvere i cambiamenti acuti nella gestione intracellulare del calcio in risposta alle applicazioni di vari agenti, misurare la concentrazione basale di calcio all'interno delle cellule (ad esempio, per valutare la progressione della malattia) e valutare e manipolare la conduttanza del calcio a livello dei singoli canali ionici.

Introduzione

I reni mantenere l'equilibrio omeostatico per varie sostanze e regolare il volume di sangue in un modo che determina la pressione totale di sangue. Disturbi della filtrazione renale, riassorbimento o secrezione causare o accompagnare stati patologici, che vanno da iper- o ipotensione per terminare malattia renale allo stadio che alla fine richiede il trapianto di rene. L'unità di filtrazione renale (glomerulo) consiste di tre strati - l'endotelio capillare, membrana basale e uno strato cella singola di cellule epiteliali - podociti, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità e della funzione ¹ fessura diaframma. Disfun....