Viene presentato un protocollo per valutare i cambiamenti nei livelli di danno al DNA e nella capacità di riparazione del DNA che possono essere indotti dall'irradiazione cronica in vivo a basse dosi nei linfociti della milza di topo, misurando l'istone fosforilato H2AX, un marcatore di rotture del doppio filamento del DNA, utilizzando la citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Esposizione radiazione bassa dose può produrre una varietà di effetti biologici che sono diversi nella quantità e qualità degli effetti prodotti dalle alte dosi di radiazioni. Affrontare le questioni relative alla sicurezza della salute ambientale, occupazionale e del pubblico in modo adeguato e scientificamente giustificata pesantemente si basa sulla capacità di misurare con precisione gli effetti biologici degli inquinanti a basso dosaggio, come ad esempio le sostanze ionizzanti radiazioni e chimiche. Danno al DNA e riparazione sono i più importanti indicatori precoci di rischi per la salute a causa delle loro potenziali conseguenze a lungo termine, come il cancro. Qui si descrive un protocollo per studiare l'effetto di cronica esposizione vivo a basse dosi di γ- e β-radiazione sul danno e riparazione del DNA nelle cellule del mouse milza. Con un pennarello comunemente accettata di DNA rotture del doppio filamento, fosforilata H2AX istone chiamato γH2AX, dimostriamo come può essere utilizzato per valutare non solo i livelli di danno al DNA, ma cambia anchenella capacità di riparazione del DNA potenzialmente prodotto da basse dosi di esposizione in vivo. Citometria a flusso consente la misurazione veloce, precisa e affidabile di immunofluorescently etichettato γH2AX in un gran numero di campioni. DNA a doppio filamento break riparazione può essere valutata esponendo splenociti estratte ad una dose di 2 Gy impegnativo per produrre un numero sufficiente di DNA rompe per innescare riparazione e misurando l'indotto (1 hr post-irradiazione) e danno al DNA residuo (24 ore post-irraggiamento). Danno al DNA residuo sarebbe indicativo di riparazione incompleta e il rischio di instabilità genomica a lungo termine e il cancro. In combinazione con altri metodi e punti finali che possono essere facilmente misurati in tali studi in vivo (ad esempio, aberrazioni cromosomiche, frequenze micronuclei in reticolociti midollo osseo, l'espressione genica, ecc), questo approccio consente una valutazione accurata e contestuale degli effetti biologici dei fattori di stress di basso livello.
Introduzione
Polemiche significativo sopra i potenziali effetti dannosi di una dosi basse o molto basse di radiazioni e la paura del pubblico delle radiazioni, guidata da immagini dei bombardamenti atomici di Hiroshima e Nagasaki e di incidenti impianti nucleari rari ionizzanti (aggravato dai mass media), ha portato a molto regolamento sulla radioprotezione rigorosa e standard che non sono potenzialmente scientificamente giustificata. Negli ultimi tre decenni, numerosi studi hanno documentato sia la mancanza di nocivo e la presenza di effetti biologici potenzialmente benefici indotti da radiazioni a basso dosaggio 1-4. Il principale fattore di rischio per la salute di ....
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Protocollo
Tutte le procedure di manipolazione e di trattamento del mouse dovrebbero aderire alle regole stabilite dai programmi legislatore e / o la cura degli animali e approvati da un comitato di cura degli animali locale. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali, con l'approvazione del comitato di cura degli animali locale.
ATTENZIONE: Tutti i lavori con la radioattività (tra cui, ma non solo, il trattamento del trizio, γ-irradiazione esterna, la gestione tessuti animali radioattivi, rifiuti biancheria da letto) deve rispettare le regole stabilite dalle autorità legislatore e / o di p....
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Risultati
La figura 2 mostra esempi di citometria a flusso grafici previsti per splenociti preparate con il metodo descritto qui. Le cellule vengono prima gated in base alla diagramma a dispersione (Figura 2A e 2D, il volume elettronico equivale a scatter in avanti). FL3 / Propidium istogrammi iodio (figura 2B e 2E) confermano distribuzione normale ciclo cellulare. Media segnale γH2AX calcolato utilizzando .......
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Discussione
Il protocollo presentato in questo documento è utile per lo svolgimento di grandi dimensioni del mouse scala studi in vivo che esaminano gli effetti genotossici di bassi livelli di vari agenti chimici e fisici, incluse le radiazioni ionizzanti. La nostra struttura unica specifica senza germe patogeno animale dotato di una GammaBeam 150 irradiatore e una sala lunga irradiazione 30 metro permette la conduzione di studi per tutta la vita che coinvolgono irradiazioni rateo di dose bassa o molto bassa su centinaia o.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non sono noti interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i nostri colleghi Sandrine Roch-Lefevre ed Eric Gregoire dell'Istituto di Radioprotezione e Sicurezza Nucleare (Parigi, Francia). Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di Scienza e Tecnologia del Governo del Canada presso i Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), dal CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), dalla Canadian Nuclear Safety Commission e dall'Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Parigi, Francia).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HTO: acqua triziata, [3H] | ottenuta localmente da un reattore nucleare | attività stock 3,7 GBq/mL; può essere sostituito con HTO di Perkin Elmer | |
| OBT: Alanina, L-[3-3H]: trizio legato organicamente (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glicina, [2-3H]: trizio legato organicamente | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Prolina, L-[2,3-3H]: trizio legato organicamente (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| acqua tritiata, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | sostituto dell'HTO di origine locale |
| L'irradiatore GammaBeam 150 | Atomic Energy of Canada Limited | prodotto localmente | può essere sostituito con un'altra sorgente di radiazioni g di attività sufficientemente bassa. |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 con L-Glutammina e HEPES 500mL |
| siero fetale bovino | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anticorpo anti-gH2AX, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 capra anti-topo anticorpo | Life Technologies (precedentemente Invitrogen) | A21121 | |
| iodio propidio | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| etanolo | Alcoli commerciali | P006-EAAN | Flaconi da 500 ml Etanolo assoluto |
| Provette da 1,5 ml | Scientific 2682550 | provette per microcentrifuga | |
| 15 ml | Scientific | 05-539-5 | provette sterili per centrifuga in polipropilene |
| azoto liquido | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm tubi di vetro senza tappo | Fisher Scientific | K60B1496126 | tubi monouso in vetro borosilicato con estremità liscia |
| Palloni T25 | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml pallone (fornitore n. 156340) |
| forbici | Fine Science Tools | 14068-12 | Forbici Wagner 12 cm pinze affilate/affilate |
| , dritto | Fine Science Tools | 11008-13 | Pinza Semken 13 cm, pinza diritta |
| , curva | Fine Science Tools | 11003-12 | Forcipe a schema stretto 12 cm, piastre |
| di Petri curve da 60 mm | VWR | CA25382-100 | BD Falcon piastra per coltura tissutale 60 x 15 mm |
| , 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Filtri per cellule Falcon 50/caso |
| Ricetta PBS: 1 compressa sciolta in 200 ml di acqua deionizzata, regolare il pH a 7,4 se necessario. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Compresse di soluzione salina tamponata con fosfato |
| Ricetta TBS: per fare 10x brodo | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma cloridrato |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Cloruro di sodio |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Cloruro |
| di potassioSciogliere in 1 L di acqua deionizzata, regolare il pH a 7,4 |
Riferimenti
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
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Ristampe e permessi
