Organizzazione delle cellule di ossa cranio-facciali è stato a lungo ipotizzato ma mai visualizzato direttamente. Marcatura delle cellule Multi-spettrale e in vivo vivo l'imaging consente di visualizzare il comportamento delle cellule dinamica mandibola zebrafish. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di manipolare Zebrabow pesci transgenici e osservare direttamente intercalazione cellulare e cambiamenti morfologici di condrociti nella cartilagine di Meckel.
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Articolo metodologico
Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sviluppo delle strutture cranio-facciali vertebrati richiede coordinazione precisa di migrazione cellulare, la proliferazione, l'adesione e la differenziazione. Patterning della cartilagine del Meckel, un primo arco faringeo derivata, prevede la migrazione di cranico cresta neurale (CNC), le cellule e il partizionamento progressivo, la proliferazione e l'organizzazione dei condrociti differenziati. Diversi studi hanno descritto la migrazione CNC durante inferiore morfogenesi mascella, ma i dettagli di come i condrociti raggiungono organizzazione nella crescita e l'estensione della cartilagine di Meckel rimane poco chiaro. Il SOX10 limitata e indotto chimicamente Cre ricombinasi mediata ricombinazione genera permutazioni di proteine fluorescenti distinti (RFP, YFP e CFP), creando così un sistema di etichettatura multispettrale delle cellule progenitrici e la loro progenie, riflettendo popolazioni clonali distinte. Utilizzando confocale fotografia time-lapse, è possibile osservare i condrociti behavio durante lo sviluppo della cartilagine del pesce zebra di Meckel.
Etichettatura cella multispettrali consente agli scienziati di dimostrare l'estensione dei condrociti della Meckel. Durante la fase di estensione della cartilagine del Meckel, che prefigura la mandibola, condrociti intercalare di effettuare estensione come impilano in una cella singola fila stratificato organizzata. Fallimento di questo processo intercalante organizzato mediare estensione cella fornisce la spiegazione meccanicistica cellulare per mandibola ipoplasia che osserviamo in malformazioni mandibolari.
Introduzione
Sviluppo craniofacciale richiede, interazioni cellulari e tissutali complessi molecolari di guidare la proliferazione cellulare, la migrazione e la differenziazione 1,2, 3. Questo processo strettamente regolato e complesso è soggetto alle perturbazioni genetici e ambientali, in modo tale che deformità cranio facciali sono tra le malformazioni congenite più comuni 1-9. Mentre gli interventi chirurgici rimangono il cardine del trattamento per le anomalie cranio-facciali, la comprensione della base di sviluppo è essenziale per innovare terapie future. Pertanto, lo studio della morfogenesi e meccanismi nella convergenza ed estensione e integrazione ....
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Protocollo
Massachusetts General Hospital Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali (IACUC) ha approvato tutte le operazioni in numero di protocollo # 2010N000106. Ciò è in accordo con l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International (AAALAC) le linee guida.
1. Reagenti e materiali di preparazione
- Preparare 1 L di 50X medio E3 embrione (Vedi Tabella 1) e preparare 1 l di 1X E3 medio embrione (vedi tabella 2).
- Preparare E3 medio embrione con N-feniltiourea (PTU) con l'aggiunta di 30 mg di PTU a 1 L di 1X E3. Mescolare O / N per garant....
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Risultati
Visualizzazione cartilagine tradizionale da tutto il monte Alcian macchie blu è stato prezioso per osservare la sviluppo della cartilagine di Meckel e comunemente usato per visualizzare finale cellulare organizzazione 12 (Figura 1A). Per analizzare ulteriormente i condrociti in via di sviluppo straordinario, lignaggio tracciando con SOX10: linee transgeniche Kaede ci ha permesso di studiare la migrazione delle cellule, la convergenza e l'estensione in embrioni vivi 2,12
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Discussione
Alcian blue linee transgeniche e fotoconvertibile come descritto sopra complementi tra loro per definire il complesso processo di cartilagine e sviluppo osseo. Tuttavia, la migrazione cellulare dal vivo e organizzazione durante l'organogenesi è stato a lungo ipotizzato e dimostrato indirettamente ma mai visualizzato. Linea transgenica Zebrabow-M accoppiata con una cartilagine specifica Cre permette simultaneamente l'osservazione dal vivo di tutti questi eventi distinti coinvolti nella formazione delle ossa e del.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Alex Schier per gentilmente condividere la linea transgenica Zebrabow-M, Geoffrey Burns per il vettore pDEST e Renee Ethier-Daigle per un'eccellente cura della struttura pesce e le linee.
FINANZIAMENTO:
Siamo grati per il generoso sostegno finanziamento NIDCR RO3DE024490 e Shriners Hospitals for Children (ECL) e borse di formazione post-dottorato da Shriners Hospitals for Children (LR e YK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μ l. aliquote stock a 50 mg/ml |
| Metilcellulosa | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaina | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Kit di clonazione Tecnologie per | vita | K591-20 | |
| Kit di clonazione pENTR/D-TOPO  | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Regalo dai laboratori Geoffrey Burns | ||
| Microscopio a campo chiaro | |||
| Microscopio a fluorescenza | |||
| Microscopio | |||
| Software |
Riferimenti
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al.
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Ristampe e permessi
