Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Summary

Descriviamo una tecnica per misurare contemporaneamente la cinetica di legame del singolo recettore-ligando regolata dalla forza e l'imaging in tempo reale della segnalazione del calcio in un singolo linfocita T.

Abstract

Recettore-ligando membrana mediano molte funzioni cellulari. Cinetica Binding e segnalazione a valle innescato da queste interazioni molecolari sono probabilmente influenzate dall'ambiente meccanico in cui legame e segnalazione avvengono. Uno studio recente ha dimostrato che la forza meccanica può regolare il riconoscimento dell'antigene da e attivazione del recettore delle cellule T (TCR). Ciò è stato reso possibile da una nuova tecnologia che abbiamo sviluppato e fluorescenza Definito sensore di forza biomembrane (fBFP), che combina spettroscopia di forza singola molecola con microscopia a fluorescenza. L'utilizzo di un globulo rosso umano ultra-morbido come il sensore di forza sensibile, una macchina fotografica ad alta velocità e in tempo reale, le tecniche di monitoraggio delle immagini, la fBFP è di ~ 1 PN (10 ^-12 N), ~ 3 nm e ~ 0.5 msec a forza, risoluzione spaziale e temporale. Con il fBFP, si può misurare con precisione singoli cinetica di legame recettore-ligando ai sensi del regolamento vigente e allo stesso tempo l'immagine vincolante-attivato cal intracellularecico segnalazione su una singola cellula dal vivo. Questa nuova tecnologia può essere utilizzata per studiare altri recettore-ligando di membrana e la segnalazione in altre cellule sotto regolazione meccanica.

Introduction

Cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare (ECM) adesione è mediata dal legame tra i recettori della superficie cellulare, proteine ​​ECM, e / o lipidi ^1. Binding consente cellule formano strutture funzionali ^1, così come riconoscono, comunicare e reagiscono all'ambiente ^1-3. A differenza di proteine ​​solubili (ad esempio, citochine e fattori di crescita) che si legano da un tridimensionale (3D) fase fluida sui recettori di superficie cellulare, i recettori di adesione cellulare formano legami con i propri ligandi attraverso una stretta spazi di giunzione per colmare due superfici contrapposte che limitano molecola....

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida ed è stato approvato dal comitato etico della ricerca umana della Georgia Institute of Technology.

Isolamento 1. globuli rossi umani, biotinilazione e Osmolarità regolazione

Nota: I passi 1.1 deve essere effettuata da un esperto medico professionale come infermiera, con un Institutional Review Board ha approvato il protocollo.

1. Ottenere 8-10 microlitri (una goccia) di sangue dal dito puntura e aggiungere 1 ml di tampone carbonato / bicarbonato (Tabella 1 e 2). Vortice delicatamente o pipetta la miscela e centrifugare per 1 min a....

Results

La tecnica BFP è stato lanciato da laboratorio Evans nel 1995 ^17. Questo strumento picoforce è stato ampiamente utilizzato per misurare le interazioni di proteine ​​immobilizzate su superfici, in modo da analizzare la cinetica bidimensionali di molecole di adesione interagire con i loro ligandi ^{16,19,20, 30,} per misurare l'elasticità molecolare ^21,29, e per determinare proteine ​​conformazionale cambia ^21. Per un fBFP, un ulteriore set di dispositivi epi-fluorescenza connesse .......

Discussion

Un esperimento di successo fBFP comporta alcune considerazioni critiche. In primo luogo, per il calcolo forza di essere affidabile, la micropipetta, l'RBC, ed il tallone della sonda devono essere allineati come vicino coassiale possibile. La proiezione del RBC all'interno della pipetta dovrebbe essere circa un diametro della sonda pipetta in modo che l'attrito tra RBC e la pipetta è trascurabile. Per un tipico RBC umana, il diametro ottimale pipetta è 2.0-2.4 micron, che produce un migliore adattamento di Eq.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparazione tampone fosfato
Anhy. Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Preparazione tampone fosfato
Carbonato di sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparazione tampone carbonato/bicarbonato
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonato/bicarbonato Preparazione del tampone
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	N2-5% Preparazione del tampone
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	N2-5% Preparazione del tampone
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655	N2-5% Preparazione del tampone
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389	Preparazione del tampone N2-5%
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Funzionalizzazione delle perle
Biotina-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	Biotinilazione dei globuli rossi
Nistatina	Sigma-Aldrich	N6261	Regolazione dell'osmolarità dei globuli rossi
Idrossido di ammonio (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Perla di vetro silanizzazione
Metanolo	BDH	67-56-1	Silanizzazione di perle di vetro
30% Perossido di idrogeno (H2O2)	J. T. Barker	Jan-86	Silanizzazione di perle di vetro
Acido acetico (glaciale)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Silanizzazione di perle di vetro
3-Mercaptopropiltrimethoxysilane (MPTMS)	Uct Specialties, llc	4420-74-0	Funzionalizzazione di perle
vetro Borosilicato Perle di vetro	Distrilab Particle Technology	9002	Funzionalizzazione di perle di vetro
Streptavidina− Maleimmide	Sigma-Aldrich	S9415	Funzionalizzazione con perle di vetro
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Funzionalizzazione del ligando
Fura2-AM	Life Technologies	F-1201	Caricamento intracellulare del colorante a fluorescenza del calcio
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Caricamento intracellulare del colorante a fluorescenza del calcio
Perle di Quantibrite PE	BD Biosciences	340495	Quantificazione della densità
Citometro a flusso	BD Biosciences	BD LSR II	Quantificazione della densità
Tubo capillare 0,7-1,0 mm x 30 pollici	Kimble Chase	46485-1	Produzione di micropipette
Flaming/Brown Estrattore di micropipette Strumento	sutter	P-97	Produzione di micropipette
Pipetta microforce	Narishige	MF-900	Micropipetta per la produzione di
olio minerale	Fisher Scientific	BP2629-1	Assemblaggio della camera
Coperchio del microscopio Vetro	Fisher Scientific	12-544-G	Assemblaggio della camera
Micro-iniettore	World Precision Instruments	MF34G-5	Assemblaggio della camera
Siringa da 1 ml	BD	Assemblaggio della	camera
Assemblaggio della micropipetta	Narishige	HI-7	Assemblaggio della camera
Parti meccaniche e adattatori progettati in casa mediante lavorazione CNC.	Strumento di Biofisica	Tutte le parti sono personalizzate secondo i disegni CAD.	Sistema BFP
Microscopio (TiE invertito)	Nikon	MEA53100	BFP
Obiettivo CFI Piano Fluor 40x (NA 0,75, WD 0,72 mm, Spg)	Sistema Nikon	MRH00401	BFP
Fotocamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono	Graftek Imaging	02-2020C	Sistema BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, ADC a 12 bit	Graftek Imaging	02-2185A	BFP sistema
Testa di sonda submicronica manuale con telecomando ad alta risoluzione	Sistema Karl Suss	PH400	BFP
Tavolo antivibrante (5' x 3')	Sistema TMC	77049089	BFP
Tavolino traslante manuale 3D	Newport	462-XYZ-M
Software CAD 3D SolidWorks	SOLIDWORKS Corp.	Versione 2012 SP5	Sistema BFP
LabVIEW National	Instruments	Versione 2009	Sistema BFP, programma BFP
Stadio piezotraslante 3D	Physik Instrumente	M-105.3P	Sistema BFP
Piezo accuator lineare	Physik Instrumente	P-753.1CD	Sistema BFP
Software		Versione 1.4	Sistema fBFP, fluorescenza programma di imaging
Dual Cam (DC-2)	Fotometria	77054724	sistema fBFP
Filtro di emissione Dual Cam (T565LPXR)	Fotometria	77054725	sistema fBFP
Telecamera a fluorescenza	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600-10B	Sistema fBFP
Film plastico di paraffina (Parafilm)	Bemis Company, Inc	Sigillatura della bottiglia	PM996
Carbonato/ tampone bicarbonato (pH 8,5)			8,4 g/L carbonato di sodio (Na2CO3), 10,6 g/L bicarbonato di sodio (NaHCO3)
Tampone fosfato (pH 6,5-6,8)			27,6 g/L NaPhosphate monobasico (NaH2PO4 &; H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfato dibasico (Na2HPO4)
N2-5% tampone (pH 7,2)			20,77 g/L cloruro di potassio (KCl), 2,38 g/L cloruro di sodio (NaCl), 0,13 g/L fosfato di potassio monobasico (KH2PO4), 0,71 g/L di anhy. sodio fosfato bibasico (Na2HPO4), 9,70 g/L di saccarosio