Canali ionici espressi in renale tubulare svolgono un ruolo significativo nella patologia della malattia del rene policistico. Qui si descrive protocolli sperimentali utilizzati per eseguire patch-clamp analisi e di livello di calcio intracellulare misure in cistico appena isolato da reni di roditori.
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Articolo metodologico
Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cisti di iniziazione e di espansione durante la malattia del rene policistico è un processo complesso, caratterizzata da anomalie nella proliferazione delle cellule tubulari, accumulo di liquidi luminale e la formazione della matrice extracellulare. Attività di canali ionici e di segnalazione intracellulare di calcio sono parametri fisiologici fondamentali che determinano le funzioni di epitelio tubolare. Abbiamo sviluppato un metodo adatto per l'osservazione in tempo reale dell'attività canali ionici con la tecnica patch-clamp e registrazione di Ca2 + intracellulare in monostrati epiteliali livello appena isolate da cisti renali. Ratti PCK, un modello genetico di autosomica recessiva rene policistico (ARPKD), sono stati utilizzati qui per ex vivo l'analisi dei canali ionici e del flusso di calcio. Descritto qui è una procedura dettagliata passo-passo progettato per isolare monostrati cistica e tubuli non dilatata da PCK o normali Sprague Dawley (SD) ratti, e monitorare l'attività a canale singolo e intracellulari di Ca 2+ dinamiche.Questo metodo non richiede trattamento enzimatico e consente l'analisi in un ambiente nativo di fresco isolato monostrato epiteliale. Inoltre, questa tecnica è molto sensibile alle variazioni intracellulari di calcio e genera immagini ad alta risoluzione per misurazioni precise. Infine, isolato cistico può essere ulteriormente utilizzato per la colorazione con anticorpi o coloranti, preparazione di colture primarie e di purificazione per i vari saggi biochimici.
Introduzione
Canali ionici svolgono un ruolo significativo in molte funzioni fisiologiche, tra cui la crescita cellulare e la differenziazione. Malattie autosomiche dominanti e recessivi policistiche renali (ADPKD e ARPKD, rispettivamente) sono malattie genetiche caratterizzate dallo sviluppo di cisti renali piene di liquido di origine tubulare delle cellule epiteliali. ADPKD è causata da mutazioni di PKD1 o PKD2 geni che codificano policistine 1 e 2, proteine di membrana coinvolte nella regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare. PKD2 da solo o come un complesso con PKD1 funzionare anche come Ca 2+ canale cationico -permeable 1. Le muta....
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Protocollo
Le procedure sperimentali descritte qui di seguito sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Animal Istituzionale presso il Medical College del Wisconsin e l'Università del Texas Health Science Center a Houston ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Figura 1 illustra le fasi principali di isolamento tessuti e procedura di lavorazione. In breve, reni da PCK o SD ratti sono utilizzati per l'isolamento manuale di monostrati epiteliali di collettori sia da tubuli o cisti non-composto in buona salute. Qui abbiamo studiato reni da 4-16 settimane di età ratti PC....
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Risultati
Coinvolgimento potenziale ENaC in cystogenesis è stata dimostrata da diversi studi che osservano interrotto fattore di crescita epidermico (EGF) di segnalazione in PKD progressione 22-25 e riassorbimento di sodio anormale ARPKD modelli murini e colture di tessuti 26-28. Ad esempio, Veizis et al. Hanno dimostrato che amiloride-sensibile Na + assorbimento è diminuita nelle cellule CD dal non orthologous modello murino di BPK ARPKD 29. Abbiamo recentemente dimostrato che.......
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Discussione
Abbiamo descritto qui applicazioni della tradizionale tecnica del patch-clamp e di imaging epifluorescenza calcio per monostrati epiteliali cistica derivate da un modello genetico murino di ARPKD. Il protocollo consiste di tre fasi, di cui la più attenzione deve essere rivolta alla l'isolamento delle cisti (passo 1.5 della sezione di protocolli) e per gli studi elettrofisiologici. Queste procedure chiave richiedono una formazione completa e la pazienza, e il lettore non deve essere frustrato in una volta.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) per un'eccellente assistenza tecnica con esperimenti di microscopia. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (a OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (a OPO) e Ben J. Lipps Research Fellowship dalla Società Americana di Nefrologia (DVI).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Acido pluronico | Sigma-Aldrich | F-68 | soluzione |
| Agitatore | Boekel Scientific | 260350 | |
| Sorgente luminosa | Sutter Instrument Co | Lambda XL | con otturatore/driver ruota portafiltri integrato |
| Filtri a densità neutra | Nikon | ND4, ND8 | |
| Obiettivo | Nikon | SFluo | 40/1,3 DIC WD 0,22 olio |
| Fotocamera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscopio (invertito) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Matita diamantata | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Software di acquisizione immagini | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Il software di analisi delle immagini | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin consente di importare immagini nel formato nativo Nikon Instruments .nd2 |
| Camera di registrazione/perfusione | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp | amplifier Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Sistema | di acquisizione datiDispositivi molecolari | Digidata 1440A | Axon Digidata® Sistema |
| Filtro passa basso | Warner Instruments | LPF-8 | 8 poli Bessel |
| Capillari in vetro borosilicato | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instrument Co | P-97 | Estrattore per micropipette di tipo fiammante/marrone |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Giappone Micromanipolatore | motorizzatoSutter Instrument Co | MP-225 | |
| Microscopio invertito | Nikon | Eclipse Ti | |
| Tavolo di isolamento per microvibrazioni | TMC | dotato di gabbia di Faraday | |
| Sistema di perfusione della valvola multicanale | AutoMake | Scientific Valve Bank II | |
| Camera di registrazione/perfusione | Warner Instruments | RC-26 | |
| Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | ||
| Tavolo chirurgico a temperatura controllata | Nucleo | per roditori | |
| Stereomicroscopio binoculare | Nikon | SMZ745 | |
| Sistema di perfusione basato su pompa a siringa | Apparecchio Harvard Tubo | ||
| in polietilene | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Anestesia isofluorano | http://www.vetequip.com/911103 | ||
| Altri reagenti di base | Sigma-Aldrich |
Riferimenti
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recess....
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Ristampe e permessi
