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Articolo metodologico

Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium

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DOI:

10.3791/53035

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1 settembre 2015

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1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

In questo articolo

Sommario

Canali ionici espressi in renale tubulare svolgono un ruolo significativo nella patologia della malattia del rene policistico. Qui si descrive protocolli sperimentali utilizzati per eseguire patch-clamp analisi e di livello di calcio intracellulare misure in cistico appena isolato da reni di roditori.

Abstract

Cisti di iniziazione e di espansione durante la malattia del rene policistico è un processo complesso, caratterizzata da anomalie nella proliferazione delle cellule tubulari, accumulo di liquidi luminale e la formazione della matrice extracellulare. Attività di canali ionici e di segnalazione intracellulare di calcio sono parametri fisiologici fondamentali che determinano le funzioni di epitelio tubolare. Abbiamo sviluppato un metodo adatto per l'osservazione in tempo reale dell'attività canali ionici con la tecnica patch-clamp e registrazione di Ca2 + intracellulare in monostrati epiteliali livello appena isolate da cisti renali. Ratti PCK, un modello genetico di autosomica recessiva rene policistico (ARPKD), sono stati utilizzati qui per ex vivo l'analisi dei canali ionici e del flusso di calcio. Descritto qui è una procedura dettagliata passo-passo progettato per isolare monostrati cistica e tubuli non dilatata da PCK o normali Sprague Dawley (SD) ratti, e monitorare l'attività a canale singolo e intracellulari di Ca 2+ dinamiche.Questo metodo non richiede trattamento enzimatico e consente l'analisi in un ambiente nativo di fresco isolato monostrato epiteliale. Inoltre, questa tecnica è molto sensibile alle variazioni intracellulari di calcio e genera immagini ad alta risoluzione per misurazioni precise. Infine, isolato cistico può essere ulteriormente utilizzato per la colorazione con anticorpi o coloranti, preparazione di colture primarie e di purificazione per i vari saggi biochimici.

Introduzione

Canali ionici svolgono un ruolo significativo in molte funzioni fisiologiche, tra cui la crescita cellulare e la differenziazione. Malattie autosomiche dominanti e recessivi policistiche renali (ADPKD e ARPKD, rispettivamente) sono malattie genetiche caratterizzate dallo sviluppo di cisti renali piene di liquido di origine tubulare delle cellule epiteliali. ADPKD è causata da mutazioni di PKD1 o PKD2 geni che codificano policistine 1 e 2, proteine ​​di membrana coinvolte nella regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare. PKD2 da solo o come un complesso con PKD1 funzionare anche come Ca 2+ canale cationico -permeable 1. Le mutazioni del gene che codifica PKHD1 fibrocistina (una proteina recettore simil-cilia associata coinvolte nella tubulogenesi e / o manutenzione di polarità di epitelio) sono l'impulso genetico di ARPKD 2. Crescita delle cisti è un fenomeno complesso accompagnato da proliferazione disturbato 3,4, angiogenesi 5, dedifferenziazione e la perdita di polarilità di cellule tubulari 6-8.

Riassorbimento difettoso e la secrezione aumentata in cistico contribuiscono all'accumulo di liquidi nel lume e cisti espansione 9,10. Flusso-dipendente alterata [Ca 2+] i segnalazione è stata anche legata alla cystogenesis durante PKD 11-15.

Qui, si descrive un metodo adatto per misure patch-clamp di attività singolo canale e intracellulari di Ca 2+ livelli in monostrati epiteliali cistiche isolati da ratti PCK. Questo metodo è stato applicato con successo da noi per caratterizzare l'attività del canale epiteliale Na + (ENaC) e 10 [Ca 2+] i indotti da processi -dipendente Ca 2+ TRPV4 -permeable e purinergica cascata di segnalazione 13.

In questi studi abbiamo utilizzato topi PCK, un modello di ARPKD causata da una mutazione spontanea nel gene PKHD1. Il ceppo PCK era originally derivate da ratti 16 ratti così SD sono utilizzati come controllo appropriato per il confronto con il ceppo Sprague-Dawley PCK (SD). Di conseguenza, entrambi i ratti nefrone SD e condotti non dilatato raccolta isolati da ratti stesso PCK possono servire come due diversi gruppi di confronto per esperimenti su cistico.

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Protocollo

Le procedure sperimentali descritte qui di seguito sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Animal Istituzionale presso il Medical College del Wisconsin e l'Università del Texas Health Science Center a Houston ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Figura 1 illustra le fasi principali di isolamento tessuti e procedura di lavorazione. In breve, reni da PCK o SD ratti sono utilizzati per l'isolamento manuale di monostrati epiteliali di collettori sia da tubuli o cisti non-composto in buona salute. Qui abbiamo studiato reni da 4-16 settimane di età ratti PCK 10,13.

1. Isolamento di renali Cisti e Tubules Collegamento (CNT) / dotti collettori (CD) Segmenti

  1. Anestetizzare animale sperimentale con isoflurano (5% di induzione, 1,5-2,5% manutenzione) / medico di grado O 2 o altro metodo riconosciuto. Gli animali devono essere costantemente monitorati per garantire un adeguato level dell'anestesia. Stabile respiratorio reazione votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
  2. Eseguire laparotomia e lavare i reni con tampone fosfato salino (PBS) attraverso l'aorta addominale 17.
    1. Preparare un catetere tubo di polietilene (PE50) e collegarlo ad una pompa siringa riempita con PBS. Tagliare la pelle e la parete addominale lungo la linea alba, poi fare una incisione addominale trasversale attraverso l'addome da un lato all'altro e spostare gli organi addominali con tamponi di cotone per ottenere l'accesso alla aorta discendente con ramificazione mesenterica e celiaci arterie. Inumidire gli organi interni con soluzione salina caldo durante ulteriori procedure per impedire la loro secchezza.
    2. Mettere una legatura (# 1) attorno ai mesenterica e celiaci arterie e un altro legature (# 2) intorno all'aorta sotto il diaframma (non tie). Separare delicatamente a. abdominalis da smussare sezionare tessuti connettivi intorno ad esso con una pinza sottile e mettere due legature ~ 3mm sotto l'arteria renale sinistra (# 3) e al di sopra della biforcazione iliaca (# 4).
    3. Legare la legatura # 4 e collegare un morsetto nave intorno all'aorta tra l'arteria renale sinistra e legature # 3. Fare un'incisione tra il morsetto e legature # 4 per cateterizzare l'aorta, utilizzare la legatura # 3 per fissare saldamente il catetere.
    4. Rilasciare il morsetto e fare in modo che l'impulso di sangue è visibile nel catetere per garantire una corretta installazione. Inizia perfusione ad una velocità di 6 ml / min, cravatta legature # 1 e # 2, e tagliare la vena renale sinistra. Continuare a lavare per 1-2 minuti fino a quando gli organi sono completamente scottati.
    5. Tagliare i vasi sanguigni renali, uretra e circostanti tessuti connettivi adiposi e con le forbici per raccogliere i reni. Poi fare un breve strappo in capsula renale e sbucciare le reni per decapsulate loro. Posizionare i reni in PBS ghiacciato. L'eutanasia è confermata da una toracotomia.
  3. Preparare 5 x 5 mm chip vetro coperchio rivestito con poli-L-lisina. Tagliare una gla copertinass con una matita diamante e posto circa 20 ml di 0,01% sterile soluzione filtrata Poly-L-lisina su ogni chip vetro. Preparare salina e due paia di pinze orologeria per la dissezione.
  4. Tagliare i reni con una lametta lungo il piano frontale in fette di ~ 1-2 mm di spessore. Mettere una delle fette sotto uno stereomicroscopio. Isolamento di tessuti dovrebbe essere fatto in soluzione salina ghiacciata.
  5. Individuare cisti allo stereomicroscopio come cavità rotondo-figura (Figura 2A); le loro pareti contengono spesso rete importante di vasi sanguigni proliferato. Uso pinze punta fine sezionano lo strato epiteliale interna di una cisti più sottile possibile per ottenere una zona monostrato. Attaccare ad un chip di vetro rivestito con poli-L-lisina. Appiccicoso superficie Poly-L-lisina permette al ricercatore di posizionare saldamente lo strato cisti interna su vetro. Esporre la cisti con il lato apicale per fornire l'accesso alle pipette (Figura 2B).
  6. Utilizzare PCK o ratto SD bambinofette centrali ney contenenti papilla per l'isolamento di non dilatate CNT / CCDsegments 18-21.
    NOTA: i tessuti papillari sono più durevoli di corteccia e tenendo fasce tubolari papillari con una pinza e strappando lungo l'asse radiale fetta può essere scisso in settori sottili. Tubuli individuali sono visibili e possono essere estratte per essere immessi sul chip di vetro di copertura.
  7. Identificare i segmenti CNT / CCD da biforcazioni, una maggiore trasparenza di tubuli prossimali e grandi cellule prominente visibili (Figura 2C). Posizionare il chip vetro di copertura con tubuli collegati al microscopio equipaggiato con micromanipolatori adatti per micropipette guida. Utilizzando micropipette taglienti tubuli split-aperti e fissare i bordi al vetro per rendere la superficie apicale accessibili (Figura 2D).

Elettrofisiologia 2. Single Channel Patch-clamp

  1. Riempire la camera del patch-clamp con soluzione del bagno e trasferire il chip vetro di coperturacon tessuti isolati alla camera. Assicurarsi che le micropipette patch-clamp hanno una resistenza di 7-10 MW per misurazioni affidabili (cella-attached) su celle.
  2. Per le misure di cella-attached, impostare il rapporto di guadagno dell'amplificatore a 20x e passa-basso le correnti a 300 Hz, da un filtro a otto poli Bessel. Per il monitoraggio canali ENaC, utilizzare una soluzione del bagno, in mm: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7,4); pipetta: 140 LiCl, 2 MgCl 2 e 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Condurre un esperimento di patch-clamp convenzionale in una modalità cella-attached 10. Selezionare una cella nel monostrato epiteliale e avvicinare la pipetta alla membrana apicale. Formare una guarnizione ad alta resistenza tra la pipetta e la membrana cellulare applicando aspirazione delicata. Una volta che un ad alta resistenza di tenuta gigaohm è formato, un protocollo senza gap ad un potenziale in possesso deve essere avviato un'attività di monitoraggio del canale di interesse.
  4. Dati del canale unico negozio gap-liberi corrente da gigaGuarnizioni Ohm per successive analisi. Analizzare gli eventi canale utilizzando un pacchetto software generalmente fornito con configurazioni di patch-clamp 18. Calcolare canale attività come NpO dove N indica il numero di canali attivi nella patch e P o è probabilità media aperta dei canali.
    NOTA: Utilizzare le cisti isolate o tubuli in esperimenti di patch-clamp per non più di 30 min.

3. Raziometrico epifluorescenza misurazioni della concentrazione intracellulare di calcio nelle cellule epiteliali

  1. Utilizzare 5 mM Fura-02:00 sciolto in DMSO. Soluzione Aliquota magazzino in tubi conici singoli 500 microlitri (circa 10 ml). Proteggere dalla luce e conservare in freezer a -20 ° C per un massimo di sei mesi.
  2. Incubare le cisti isolate e tubuli spaccatura-aperto per 30-40 minuti a PSS (in mm: 145 NaCl, KCl 4.5, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 e 10 HEPES a pH 7,35) contenenti 5 mM Fura-02:00 colorante e 0.05% di acido Pluronic per aiutare disperdere le esteri acetossimetil. Per questo, posto tessuti del piatto 3.5 cm contenente loading cocktail, proteggere dalla luce e incubare su un agitatore lento a temperatura ambiente.
  3. Cambia Fura-02:00 contenenti supporti per pulire PSS dopo l'incubazione e posizionare il tessuto al microscopio per eseguire ulteriori immagini epifluorescenza.
  4. Accendere camera CCD e luce stabile (sistema monocromatore) dotata di ruota portafiltri (ogni posizione del filtro può essere associato ad un proprio livello di attenuazione, selezionato ogni volta che il filtro è chiamato).
  5. Trova il tessuto in campo chiaro. Passare il rilevamento del segnale di fluorescenza e regolare l'intensità della sorgente di luce utilizzando filtri a densità neutra e potenza della lampada per evitare la saturazione del segnale.
  6. Monitor Fura-2 AM fluorescenza nel campione di tessuto con eccitazione a 340/380 nm raziometrico con una frequenza di 0,125 Hz o superiore. Utilizzare un 40 × / NA 1.3 o simile lenti dell'obiettivo per una corretta risoluimmagine zione.
  7. Per l'elaborazione delle immagini e calcoli importare la sequenza di immagini. Assicurati di dividere i canali e utilizzare una modalità HyperStack scala di grigi. Seleziona più regioni di interesse (cellule singolo cisti o aree selezionate di tessuto cistica) e calcolare i valori di intensità per ciascun canale (340 e 380 nm) in preferito software di analisi dei dati; sottrazione di valori di intensità di fondo da ogni punto di dati.
  8. Per ogni punto di tempo calcolare il rapporto tra intensità delle 340 a 380 canali Fura-2 AM. Grafico a dispersione / linea point-tempo cambia di Ca 2+ transitoria per ogni regione e calcolare i valori medi / SE.

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Risultati

Coinvolgimento potenziale ENaC in cystogenesis è stata dimostrata da diversi studi che osservano interrotto fattore di crescita epidermico (EGF) di segnalazione in PKD progressione 22-25 e riassorbimento di sodio anormale ARPKD modelli murini e colture di tessuti 26-28. Ad esempio, Veizis et al. Hanno dimostrato che amiloride-sensibile Na + assorbimento è diminuita nelle cellule CD dal non orthologous modello murino di BPK ARPKD 29. Abbiamo recentemente dimostrato che...

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Discussione

Abbiamo descritto qui applicazioni della tradizionale tecnica del patch-clamp e di imaging epifluorescenza calcio per monostrati epiteliali cistica derivate da un modello genetico murino di ARPKD. Il protocollo consiste di tre fasi, di cui la più attenzione deve essere rivolta alla l'isolamento delle cisti (passo 1.5 della sezione di protocolli) e per gli studi elettrofisiologici. Queste procedure chiave richiedono una formazione completa e la pazienza, e il lettore non deve essere frustrato in una volta.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) per un'eccellente assistenza tecnica con esperimenti di microscopia. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (a OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (a OPO) e Ben J. Lipps Research Fellowship dalla Società Americana di Nefrologia (DVI).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP4707
Acido pluronicoSigma-AldrichF-68 soluzione
AgitatoreBoekel Scientific260350
Sorgente luminosaSutter Instrument CoLambda XLcon otturatore/driver ruota portafiltri integrato
Filtri a densità neutraNikonND4, ND8
ObiettivoNikonSFluo 40/1,3 DIC WD 0,22    olio
FotocameraAndor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  microscopio (invertito)NikonNikon Eclipse TE2000-S
Cover GlassThermo Scientific6661B52
Matita diamantataFisher Scientific22268912
Software di acquisizione immaginiNikonNikon NIS-Elements
Il software di analisi delle immaginiImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility plugin consente di importare immagini nel formato nativo Nikon Instruments .nd2
Camera di registrazione/perfusioneWarner InstrumentsRC-26
Patch Clampamplifier Molecular DevicesMultiClamp 700B
Sistemadi acquisizione datiDispositivi molecolariDigidata 1440AAxon Digidata® Sistema
Filtro passa bassoWarner InstrumentsLPF-88 poli Bessel
Capillari in vetro borosilicatoWorld Precision Instruments1B150F-4
Estrattore per micropipetteSutter Instrument CoP-97Estrattore per micropipette di tipo fiammante/marrone
MicroforgeNarishigeMF-830
Giappone MicromanipolatoremotorizzatoSutter Instrument CoMP-225
Microscopio invertitoNikonEclipse Ti
Tavolo di isolamento per microvibrazioniTMCdotato di gabbia di Faraday
Sistema di perfusione della valvola multicanaleAutoMakeScientific Valve Bank II
Camera di registrazione/perfusioneWarner InstrumentsRC-26
Molecular DevicespClamp 10 . 2
Tavolo chirurgico a temperatura controllata Nucleoper roditori
Stereomicroscopio binoculareNikonSMZ745
Sistema di perfusione basato su pompa a siringaApparecchio Harvard Tubo
in polietileneSigma-AldrichPE50
Anestesia isofluoranohttp://www.vetequip.com/911103
Altri reagenti di baseSigma-Aldrich
Software MCW

Riferimenti

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