Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

Sommario

Viene presentato un metodo per la diffusione superficiale dei cromosomi dal lievito in gemmazione. Questo metodo è derivato da un metodo precedentemente descritto da Loidl e Klein. Inoltre, dimostriamo una procedura per l'immunocolorazione dei cromosomi diffusi.

Abstract

Le piccole dimensioni dei nuclei del lievito Saccharomyces cerevisiae limitano l'utilità della microscopia ottica per l'analisi della distribuzione subnucleare delle proteine legate alla cromatina. La diffusione superficiale dei nuclei di lievito provoca l'espansione della cromatina senza perdita di proteine legate. Un metodo per la diffusione superficiale bilancia la fissazione delle proteine legate al DNA con il trattamento detergente. Il metodo dimostrato è leggermente modificato da quello descritto da Josef Loidl e Franz Klein^1,2. Il metodo è stato utilizzato per caratterizzare la localizzazione di molte proteine legate alla cromatina in vari stadi del ciclo cellulare mitotico, ma è particolarmente utile per lo studio delle strutture cromosomiche meiotiche come i ricombinosomi meiotici e il complesso sinaptonemale. Descriviamo anche una modifica che non richiede l'uso di Lipsol, un detergente proprietario, che era richiesto nella procedura originale, ma non più disponibile in commercio. Viene inoltre descritto un protocollo di immunocolorazione compatibile con il metodo di diffusione cromosomica.

Introduzione

Il lievito Saccharomyces cerevisiae in erba offre numerosi vantaggi per gli studi di meccanismi molecolari di processi biologici, tra cui lo studio delle proteine ​​che controllano la funzione cromosoma. Anche se ci sono vantaggi ben noti di gemmazione di lievito per gli studi genetici, molecolari e biochimici, gli studi citologici della distribuzione delle proteine ​​nel nucleo della cellula è complicata dalla sua piccola dimensione. Il tipico nucleo lievito ha un diametro inferiore a un micron, che è solo circa 5 volte il limite di risoluzione di luce visibile. Pertanto, la quantità di informazioni sulla distribuzione delle proteine ​​nucleari che possono essere ottenuti da immunostaining convenzionale o utilizzando i tag proteine ​​fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP), è limitata. Un approccio utile per caratterizzare la distribuzione subnucleare delle proteine ​​è superficiale cromosoma diffusione. Questo approccio comporta la rimozione della parete cellulare, interrompendo cellule e membrane nucleari, ellowing il contenuto insolubili del nucleo di stabilirsi sulla superficie di un vetrino da microscopio. Questi componenti insolubili includono matrice nucleare e cromosomi. Oltre a consentire la rimozione del contenuto nucleari solubili, che aumenta la capacità di rilevare le proteine ​​legate alla cromatina, il cromosoma diffusione metodo comporta sostanziale decompressione dei cromosomi tale che i nuclei diffusione hanno diametri di circa 3 a 5 micron (per nuclei meiotica diploidi) e 2-3 micron per nuclei mitotico diploidi. Questo permette di individuare la decompressione di sottostruttura nucleare che è relativamente difficile o impossibile da risolvere nei nuclei intatti.

Un difetto evidente al cromosoma diffusione è la possibilità che la procedura di diffusione può parzialmente o completamente distruggere la struttura di interesse. Di particolare interesse è che un particolare cromosoma vincolato proteina potrebbe essere perso come conseguenza della procedura diffusione. Questo potenziale shou complicazioneld essere tenuto presente quando si interpretano i dati. Un esempio di una proteina che è sensibile alla procedura di diffusione è la beta-tubulina. In alcune condizioni, il mandrino, che è composto principalmente di tubulina, viene preservata durante lo spandimento ^3. Visualizzazione del mandrino è spesso utile per mettere in scena i nuclei di interesse. Tuttavia, visualizzando tubulina richiede un trattamento con un fissatore alta concentrazione; mandrini sono persi nelle condizioni standard descritte di seguito. Questo esempio dimostra che, quando si analizza la distribuzione di una proteina precedenza uncharacterized, è importante variare la concentrazione di fissativo per determinare la sensibilità del proteina è a tale variazione. Nonostante la preoccupazione per l'impatto delle condizioni di diffusione sulla struttura cromosomica, l'utilità e la potenza del metodo di diffusione è stata dimostrata in molti contesti e ha un ampio programma di utilità nella caratterizzazione di mitotico e, in particolare le cellule meiotiche ^4-7.

Two metodi di diffusione sono stati ampiamente utilizzati. Il primo di questi metodi, sviluppato da Dresser and Giroux ^8, evita l'uso di detergenti e può produrre preparati diffusione che sembrano avere relativamente ben conservato morfologia dei cromosomi durante la colorazione per lo specifico DNA colorante DAPI. Tuttavia, questo metodo è relativamente difficile da perfezionare e la qualità dei nuclei spread varia drammaticamente, quando una regione di una diapositiva viene confrontato con altre regioni. Questo problema può complicare approcci quantitativi che coinvolgono l'imaging molti nuclei non selezionati da una diapositiva per evitare distorsioni dei dati di acquisizione. Il secondo cromosoma metodo di diffusione, sviluppato da Loidl e Klein ^1, comporta bilanciamento fissazione con paraformaldeide, con lisi e decompressione cromatina promosso da una soluzione detergente. Se correttamente eseguita, questo metodo dà risultati molto riproducibili con meno variazioni da regione a regione, rispetto al metodo Dresser and Giroux. Questa presentazione si concentra su un modified versione del metodo di Loidl e Klein, a causa della sua affidabilità e semplicità.

Cromosoma diffusione non è complicato o che richiede tempo; fino a 100 vetrini possono essere preparate per immunocolorazione in un solo giorno. Inoltre, i preparativi di diffusione possono essere conservati in congelatore per gli anni precedenti al immunoistochimica, e quindi i laboratori in grado di sviluppare un archivio degli spread cromosomiche congelati che può essere utilizzato quando nuove questioni biologiche sorgono o nuovi reagenti di colorazione diventano disponibili.

Il metodo cromosoma diffusione è più comunemente usato in combinazione con immunocolorazione e microscopia a fluorescenza widefield, ma è anche possibile preparare vetrini per super-risoluzione leggeri metodi microscopici quali l'esaurimento emissione stimolata (STED) microscopia.

Protocollo

NOTA: Alcune fasi del protocollo di seguito richiedono che lavora in una cappa aspirante pulito. Inoltre, il metodo richiede un microscopio di dissezione lievito tetrad dotato di un obiettivo 10X distanza di funzionamento lunga monitorare spheroplasting. Il microscopio dovrebbe essere istituito nel cofano prima del tempo. Rimuovere il braccio micromanipolatore e portatarga dal campo di applicazione e inserire questi elementi in un luogo sicuro, lontano dalla zona di lavoro.

1. Preparazione di sferoplasti

1. Crescere lievito in condizioni desiderate. Uso circa 2 x 10 ⁸ cellule per ogni campione, ad esempio 4 ml di una coltura a OD600 = 1,4 5 x 10 ⁷ cellule / ml. Sebbene trasformazione immediata di campioni può essere preferibile in alcuni casi, per la maggior parte delle applicazioni, aliquote di cellule possono essere conservate in ghiaccio per 8 ore prima di essere elaborato.
2. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e di spin in una centrifuga clinica a fissare 5 (2345 giri / 857,5 xg) per 3 minuti per far sedimentare le cellule.
3. Decantare il mezzo facendo attenzione a non perdere le cellule dal pellet. Risospendere delicatamente le cellule in tampone ZK 1 ml e aggiungere 40 ml 1 M ditiotreitolo (DTT). Incubare 2 min con miscelazione delicata. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2).
4. Pellet Risospendere nel buffer ZK 1 ml. Aggiungere 5 ml di una soluzione appena preparata di 100T zymolyase che è stato accuratamente miscelati. Incubare per 20-30 minuti a 30 ° C per rimuovere la parete cellulare e produrre sferoplasti.
5. Analizzare una goccia 10 ml di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio per determinare se spheroplasting è completa. Le cellule viste al microscopio dissezione senza un vetrino. Le cellule devono apparire gonfio e rotondo, piuttosto che un po 'allungata e dovrebbero lisare seguito all'aggiunta di 20 ml di acqua. Se le cellule non riescono a lisare, restituire il campione a 30 ° C e ri-test ogni 10 minuti fino a quando l'acqua indotta lisi è facilmente osservabili. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2).
6. Risospendere delicatamente e lavare cellule pellet in 2,5 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). Risospendere delicatamente pellet di cellule in 300-400 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Le celle possono essere tenuti in ghiaccio in questa fase per diverse ore.

2. Diffondere Cromosoma

NOTA: Le superfici di vetro su cui si diffondono, sia cromosomi diapositive o coprioggetto-dovrebbe essere preparata in anticipo. Ogni diapositiva o coprioggetto devono essere immersi in acqua, poi EtOH, poi lasciato asciugare e lucidato con carta per lenti. Se cromosomi saranno distribuite su vetrini, il vetrino deve essere apposto su un vetrino con nastro adesivo o mastice. Se non diversamente indicato, il resto del protocollo descriverà diffusione sia su un vetrino o coprioggetto

1. Usando una pipetta P20, pipetta 20 ml di sospensione cellulare sulla superficie di un vetrino pulito.
2. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 40 ml di PFA / soluzione di saccarosio 3% e mescolare delicatamente la solution da "agitando" il vetrino con la mano fino a quando le linee Schlieren scompaiono. Mettere vetrino sotto il microscopio e confermano che le cellule sono a fuoco. La soluzione PFA deve essere appena preparata nella cappa il giorno di utilizzo.
   NOTA: Se la proteina di interesse non è stato esaminato con il metodo precedentemente, è consigliabile preparare diapositive utilizzando soluzioni contenenti 2 e 4% PFA per determinare se la ritenzione della proteina è sensibile alle condizioni di fissazione. Una soluzione / di saccarosio 4% PFA viene utilizzato nei casi in cui è auspicabile visualizzare microtubuli di tubulina associati. Lo svantaggio della maggiore concentrazione fissativo è che i cromosomi saranno "underspread," 2% PFA tende anche a produrre cromosomi "underspread".
3. Usando una pipetta P200, aggiungere 80 ml di 1% Lipsol, agitare come prima per miscelare soluzioni più completamente possibile, avviare un timer. Se Lipsol non è disponibile, 80 microlitri 1% NP40 o 80 ml ​​dH ₂ O possono esseresostituito (vedi Rappresentante dei risultati, figura 2).
4. Guarda con attenzione e delicatamente le cellule agitare il vetrino ogni 15 secondi. Quando circa l'80% delle cellule ha lisato (scomparsi) fermare il timer, rimuovere immediatamente il vetrino da microscopio, aggiungere 80 ml di PFA / soluzione di saccarosio, e agitare per mescolare. Lysis dovrebbe verificarsi di tra 30 e 90 sec dopo aver avviato il timer.
   NOTA: Se più diapositive mostrano lisi a circa lo stesso tempo, si può eventualmente omettere monitoraggio microscopico per il resto delle diapositive e semplicemente il tempo accuratamente periodo tra aggiunta di lipsol e l'aggiunta della parte aliquota finale del fissativo. Tuttavia, questa scorciatoia è affidabile soltanto durante la preparazione più diapositive dallo stesso campione. E 'meglio monitorare lisi di ciascun campione microscopicamente quando diverse diapositive sono preparati da campioni prelevati in momenti diversi o da culture diverse.
5. Posizionare il vetrino su una superficie piana e pulita e diffondere il liquido su tutta la surfac unfrostede della slitta con il lato di un pulito monouso pipetta pascolo tenuto sotto del menisco del "pozza", ma al di sopra della superficie della slitta stessa, cioè. non "rastrello" la superficie del vetrino con la pipetta. Non riutilizzare pipetta su diapositive diverse per evitare la contaminazione dei campioni.
6. Lasciare i vetrini ad asciugare durante la notte nella cappa. Componenti nucleari insolubili si depositerà sulla superficie di scorrimento e si legano ad esso. Per grandi esperimenti, pianificare l'uso dello spazio per la fase di asciugatura è importante.
7. Una volta essiccato, i risultati migliori si ottengono procedendo alla fase immunocolorazione lo stesso giorno. Tuttavia, la soluzione di saccarosio essiccato incorpora i cromosomi diffusione in un "miele" che permette congelamento dei campioni: vetrini possono essere trasferiti ad una cassa scorrevole plastica e conservati a -20 ° C per anni.

3. Immunostaining

1. Immergere i vetrini in 0,2% Foto-Flo per 30 sec. per rimuovere il miele. Diapositive Lean Onun bordo, con il bordo di riposo su un tovagliolo di carta per rimuovere residui Photo-Flo.
2. Immergere i vetrini in 1x TBS per 5 minuti per lavare. Rimuovere il liquido in eccesso appoggiandosi diapositive su uno spigolo, ma non lasciarli asciugare.
3. Posare diapositive glassato lato alto, pipetta 300 ml di TBS / BSA sul vetrino attraverso la porzione unfrosted della diapositiva.
4. Incubare in una camera umida a temperatura ambiente per 15 min. (Grande contenitore di plastica rivestito con acqua satura di tovaglioli di carta sotto una lastra di metallo o di plastica scivolo box traforata con tovaglioli di carta saturi).
5. Drain diapositive appoggiando una breve bordo del vetrino su un tovagliolo di carta e appoggiato la slitta contro un supporto appropriato (ad esempio un tubo cremagliera test). Non lasciare asciugare la superficie.
6. Applicare immediatamente 80 ml di tampone TBS / BSA contenente la diluizione appropriata di anticorpo primario. Se l'anticorpo è limitante, utilizzare 40 ml e un coprioggetto mm 22 x 22. Per siero di coniglio greggio, questo è in genere tra una diluizione 1/50 e 1/500.
   NOTA:Eseguire titolazioni di nuovi preparati di anticorpi. La preparazione più diluita che produce segnale alto sopra sfondo è scelto. Per controllare il livello di colorazione di fondo, i nuclei devono essere preparati dal ceppo mutante di delezione appropriati e / o diapositive duplicati deve essere macchiato con siero pre-immune.
7. Posizionare un lucido 22 x 50 mm coprioggetto sul vetrino evitando bolle. A tale scopo, tenendo il vetrino tra il pollice e l'indice sul lato lungo in posizioni vicino a uno lato corto. Tenendo il vetrino a 30 ° rispetto a scivolare, la breve lontano bordo dalle dita si abbassa fino ad appoggiarlo sul vetrino appena all'interno del bordo della "pozza" vicino alla regione smerigliato della diapositiva. Poi abbassare lentamente il vetrino in un movimento fluido fino a quando le dita che reggono il tocco diapositiva in panchina, e poi rilasciarlo. Non tentare di regolare la posizione del vetrino, una volta che atterra.
   NOTA: Se spread cromosomiche sono stati preparati sucoprioggetto apposti (anziché direttamente sulla superficie di diapositive), questo campione coprioggetto rimarranno apposta sulla slitta durante la procedura di colorazione e lavaggio. Un vetrino supplementare sarà posto sulla parte superiore del vetrino campione per distribuire uniformemente la soluzione di anticorpi durante la colorazione e quindi scartato.
8. Posizionare i vetrini in una camera umida sigillata e incubare una notte a 4 ° C.
9. Tenendo il trasferimento bordo smerigliato i vetrini in una colorazione rack di vetrino e immergere in una vaschetta di colorazione contenente TBS.
10. Immergere delicatamente il vetrino su e giù per rimuovere il vetrino. Cercate di non usare troppa forza per farlo. Lavare le diapositive 2x 10 min immergendo in TBS. Togliere i vetrini dalla rastrelliera e drenare i liquidi in eccesso toccando bordo di un tovagliolo di carta. Non lasciare che la superficie asciutta.
11. Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere immediatamente 80 microlitri TBS / BSA contenente un 1 / 1.000 volte diluizione fluorocromo anticorpo secondario coniugato (o 40 ml con un coprioggetto 22 x 22 mm). Annunciod coprioggetto come prima e incubare a 4 ° C per 2 ore nella camera umida al buio.
12. Rimuovere coprioggetto come prima, scolare scivoli, e consentire superficie asciugare per 1 a 2 ore al buio. Diapositive Lean On asciugamani di carta come prima.
    NOTA: se la diffusione è stata eseguita su un vetrino montato, staccare il vetrino dalla diapositiva prima di asciugare. I vetrini vengono poi essiccati come descritto per diapositive nel passaggio precedente.
13. Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere circa 30 ml di mezzo contenente DAPI (tre 10 gocce microlitri) di montaggio e poi con attenzione abbassare un vetrino. Se gli spread sono su vetrini, posizionare le gocce di mezzo di montaggio su un vetrino pulito ed abbassare il vetrino, lato cromosoma verso il basso, sul vetrino.
14. Sempre sotto la luce soffusa, attendere 2 minuti per vetrino di stabilirsi e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente. Mettere i vetrini in una scatola di guida piatta.
    NOTA: Per la microscopia STED, montare con Prolong oro. Utilizzare 30 ml di prolungare Orosenza DAPI e permettono di curare tutta la notte. Tenuta con smalto non è necessaria.
15. Lettura dei vetrini di epifluorescenza widefield con 40 o un obiettivo 100X utilizzando un set di filtri appropriati per DAPI per mettere a fuoco. Facoltativamente memorizzare il vetrino al buio a 4 ° C per diverse settimane. Non congelare.

Risultati

La comparsa di nuclei di diffusione dipende in modo critico sul bilanciamento tra cromosomi fissazione e de-compattazione. Anche quando i reagenti sono correttamente bilanciati, variazione del grado del cromosoma de-compattazione può verificarsi in diverse regioni della stessa diapositiva e / o tra diverse diapositive. Pertanto, la qualità di spread in una data regione di un vetrino deve essere valutato prima immagini vengono interpretati.

Gli effetti della "invadendo" e "unde...

Discussione

La comparsa di nuclei diffusi dipende in modo critico dall'equilibrio tra fissazione e lisi/trattamento detergente. Come discusso in precedenza, la conservazione di strutture cellulari variabili richiede l'uso di diverse concentrazioni di PFA. Per la maggior parte delle proteine, il 3% di PFA è ottimale. Tuttavia, la conservazione dei fusi richiede l'uso di PFA al 4%. Anche con un singolo set di reagenti, anche la tempistica della lisi rispetto alla fissazione può influenzare la qualità dei nuclei diffusi. Per ottener...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Zymolyase	US Biological	Z1004	Preparare una soluzione di 20 mg/mL in 50 mM Tris pH 7,5 addizionato con glucosio al 2%. Prepara fresco ogni esperimento e conservalo a 4 gradi; C fino al momento dell'uso.
Lipsol	L.I.P. Ltd	non più disponibile in commercio	Preparare una soluzione all'1% (v/v) in acqua. Conservare con ghiaccio.
NP-40	USB	19628	Preparare una soluzione all'1% (v/v) in acqua. Conservare con ghiaccio.
Tween 20	Sigma	P2287
Vetrini	Corning	2948-75x25
Vetrino coprioggetti standard	Fisher	12-544-E o 12-540-B
Vetrini coprioggetti ad alta risoluzione	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 soluzione	Kodak	P-7417	Preparare la soluzione allo 0,2% (v/v) in acqua.
TBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Preparare una soluzione all'1% (p/v) in TBS. Conservare a 4 gradi C per un massimo di un mese.
Anticorpo
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Anticorpo
Vectashield supporti di montaggio con DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Scatola di vetrini in plastica	Fisher	03-448-1	Conservare i vetrini contenenti creme spalmabili essiccate in fessure a -20°C. Inoltre, utilizzare come camera umida.
Scatola di cartone per vetrini	Fisher	12-587-10	Utilizzare per trasportare comodamente vetrini macchiati/sigillati o per conservarli a 4 gradi.
Barattolo Coplin	Fisher	08-816	Utilizzabile come lavabo per scivoli.

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