Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Sommario

L'infezione da tubercolosi umana è un processo complesso, difficile da modellare in vitro. Qui descriviamo un nuovo modello 3D di tessuto polmonare umano che ricapitola le dinamiche che si verificano durante l'infezione, tra cui la migrazione delle cellule immunitarie e la formazione precoce del granuloma in un ambiente fisiologico.

Abstract

La tubercolosi (TB) detiene ancora una grave minaccia per la salute delle persone in tutto il mondo, e non vi è la necessità di modelli di costo-efficienti ma affidabili per aiutarci a capire i meccanismi della malattia e avanziamo le scoperte di nuove opzioni di trattamento. In vitro su colture cellulari di monostrati o co-colture hanno la (3D) ambiente tridimensionale e le risposte del tessuto. Qui, descriviamo un innovativo modello in vitro di un tessuto polmonare umano, che promette di essere uno strumento efficace per lo studio delle complesse vicende che si verificano durante l'infezione da Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Il modello di tessuto 3D consiste di cellule epiteliali e fibroblasti tessuto-specifici, che sono coltivate in una matrice di collagene sulla cima di una membrana porosa. Dopo esposizione all'aria, le cellule epiteliali e secernere muco stratificano sul lato apicale. Con l'introduzione di macrofagi primari umani infettati con M. tuberculosis alla modalità tessutil, abbiamo dimostrato che le cellule immunitarie migrano nel tessuto infetto e formano prime fasi di tubercolosi granuloma. Queste strutture ricapitolano la caratteristica distintiva di tubercolosi umana, il granuloma, che è fondamentalmente diverso o meno comunemente osservato in modelli sperimentali animali diffuse. Questo metodo di coltura organotipica consente la visualizzazione 3D e analisi quantitativa robusto che fornisce informazioni chiave sulle caratteristiche spaziali e temporali di interazioni delle cellule-patogeno ospite. Nel loro insieme, il modello di tessuto polmonare fornisce un tessuto micro-ambiente fisiologicamente rilevanti per gli studi sulla tubercolosi. Quindi, il modello tessuto polmonare ha potenziali implicazioni per entrambi gli studi meccanicistici e applicata di base. È importante sottolineare che il modello consente l'aggiunta o la manipolazione di tipi di cellule individuali, che si allarga quindi il suo uso per la modellazione di una varietà di malattie infettive che colpiscono i polmoni.

Introduzione

Negli esseri umani, le risposte alle infezioni, infiammazioni dei tessuti, il reclutamento cellulare, rimodellamento del tessuto e la regolazione dell'omeostasi tissutale sono eventi complessi che coinvolgono diversi tipi di cellule. Quindi, questi processi sono meglio studiati nell'ambiente tessuto locale. In precedenza, questo è stato soprattutto possibile utilizzando modelli sperimentali animali. Tuttavia, gli animali da esperimento ampiamente utilizzati tengono molti limiti come spesso rispondono a patogeni in un modo diverso da esseri umani e mostrano anche un diverso corso della malattia ^1. Un essere umano nel modello di tessuto polmonare in vitro contiene le possibilità di studiare risposte immunitarie specifiche del polmone umano.

Tubercolosi infezione umana (TB) è principalmente una malattia che colpisce i polmoni. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), l'agente eziologico della tubercolosi, raggiunge il polmone attraverso le goccioline di aerosol che vengono trasportati allo spazio alveolari, dove i batteri sono inghiottiti da dendri polmonarecellule tic e macrofagi alveolari come parte della risposta immunitaria innata all'infezione ^2,3. Fagocitosi del patogeno porta alla compartimentazione del bug all'interno di un fagosoma e idealmente provoca la neutralizzazione e l'uccisione del patogeno da parte dei fagociti. Fino al 50% di individui esposti a M. la tubercolosi si ritiene di essere in grado di eliminare l'infezione attraverso la risposta immunitaria innata ^4. Altri risultati di infezione sono rinvio della sistema immunitario adattativo in una fase successiva, l'infezione latente o nel peggiore dei casi la malattia cronica attiva ^5.

In precedenza ci sono stati modelli di tessuto in vitro per lo studio di tubercolosi umana. Singole culture cellulari di macrofagi umani o altre cellule del sangue periferico sono stati spesso usati ^6,7. Lo svantaggio di questo approccio è che non possono riflettere le dinamiche di tipi cellulari diversi operano insieme in un tessuto polmonare esposto a M. tubercolosi . Quindi, vi è la necessità di un modello in vitro per poter eseguire studi funzionali e meccanicistici sulla tubercolosi. La cella a base di modello di tessuto polmonare umano in vitro qui descritta è stata istituita dal nostro gruppo per gli studi sulle funzioni delle cellule dendritiche ^8. Abbiamo adattato questo metodo per lo studio di TB.

Il modello di tessuto polmonare umano qui presentata è composta da cellule epiteliali e fibroblasti ⁸ tessuto-specifici. Queste cellule sono coltivate in una matrice di collagene sulla cima di una membrana porosa in un inserto transwell e formano strutture simili a normale tessuto polmonare umano (Figura 1). Se esposto all'aria le cellule iniziano a secernere muco sul lato apicale ^8. Mediante l'impianto di macrofagi primari umani infettati con M. la tubercolosi al modello, abbiamo osservato come le cellule immunitarie migrano nel tessuto e formano prime fasi di granulomi TB ^9. Questo è il primo modello di tessuto umano described per la tubercolosi e pone uno strumento promettente per studiare le risposte immunitarie innate di tubercolosi e altre malattie del polmone. Fino ad oggi, abbiamo usato solo monociti e macrofagi come cellule immunitarie del modello, ma il livello di complessità può essere aumentata con l'inserimento di ulteriori tipi di cellule in questione.

Figura 1. schema Schema del modello di tessuto polmonare. (A) Il modello è composto da cellule epiteliali specifici polmonari umani, M. tubercolosi -infected macrofagi primari e colorante rosso monociti etichettati seminate su collagene incorporato fibroblasti preparati su un filtro transwell. L'esposizione del modello di tessuto all'aria avvia la produzione di proteine ​​della matrice extracellulare, secrezione di muco e stratificazione dall'epitelio. Il modello di tessuto 3D così sviluppato è uno strumento utile per lo studio M. infezione tubercolare in un ambiente che cloassomiglia Sely un polmone umano. (B) immagini microscopiche rappresentativi dei diversi passaggi della preparazione del modello di tessuto. (C) Struttura completa della sezione di tessuto modello polmonare. Scala -. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Nota: sangue periferico umano da donatori anonimi sani acquistati presso la banca del sangue di Linköping University Hospital, in Svezia è stato utilizzato come fonte di cellule immunitarie per questo studio. Questo protocollo è stato progettato per gli inserti mm 6 pozzetti 24. Adattamento diretto in altri formati e non è raccomandato in quanto i contratti tipo di tessuto sia verticalmente che orizzontalmente durante lo sviluppo.

1. Preparazione dei Materiali, Media e Cultura di batteri / linee cellulari

1. Cultura di batteri:
   1. Far crescere la tensione micobatteri M. tuberculosis H37Rv portando il plasmide pFPV2 esprimere costitutivamente la proteina fluorescente verde (GFP), in Middlebrook 7H9 mezzo contenente 0,05% Tween-80, 0,5% glicerolo, kanamicina (20 mcg / ml), e completato con Middlebrook albumina, destrosio e catalasi arricchimento ( Middlebrook ADC arricchimento), a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 7-10 giorni.
      Nota: Tutti passo sperimentales coinvolgendo vivo virulenta M. ceppi di tubercolosi devono essere eseguite in una struttura BSL-3.
2. Preparare Modified Eagle Medium (DMEM) terreno completo di 1x Dulbecco (supplementato con piruvato 1 mM di sodio, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, HEPES 10 mM, 0,1 mM aminoacidi non essenziali e 10 % di calore-inattivato siero fetale bovino (FBS)). Preparare anche antibiotici gratis terreno completo DMEM.
3. Preparare 1x Essential Medium (MEM) terreno minimo completa (1 mM sodio piruvato, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 10 mM HEPES, 0,1 mM aminoacidi non essenziali e 10% calore inattivato siero fetale bovino (FBS)).
4. Preparazione di fibronectina / boccette collagene rivestite (totale 10 ml):
   1. Pipetta fosfato 1x 8,8 ml di soluzione fisiologica sterile (PBS) in una provetta pulita. Aggiungere 1 ml di siero albumina bovina (1 mg / ml), 100 microlitri di tipo I collagene bovino (3 mg / ml) e 100 microlitri ricombinante human fibronectina (1 mg / ml).
   2. Miscelare la soluzione ruotando il tubo capovolto 5 volte. Boccette sono rivestiti con una soluzione di fibronectina / collagene (1 ml di T-25 e 2 ml di un pallone T-75). Lasciare O / N a 37 ° C. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione e memorizzare le fiasche rivestite a RT.
      Nota: La soluzione raccolta può essere conservato a 4 ° C e riutilizzato per tre volte. Bagagli per più di 2 settimane può causare il liquido a diventare marrone (formazione di cristalli), dove al momento deve essere scartata.
5. Cultura dei fibroblasti:
   1. Crescere e mantenere MRC-5, (una linea cellulare di fibroblasti polmonari umane derivate da tessuto polmonare normale di 14 settimane feto di sesso maschile), in DMEM completo in _5% CO 2 a 37 ° C. Utilizzare i fibroblasti a passaggi 24-26 e crescere fino a 70-80% confluenti.
      Nota: MRC-5 linea cellulare al passaggio> 30 tendono a perdere la morfologia e non è raccomandato nel modello del tessuto.
6. Cultura di cellule epiteliali:
   1. Ottenere 16HBE14o- (16HBE), una linea di cellule epiteliali bronchiali umane immortalato che conserva la morfologia differenziata e la funzione di normale epiteli delle vie aeree umane, (questo è stato un regalo da Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Francisco , ^{USA. 10).} Cellule Cultura 16HBE in fibronectina / flaconi collagene rivestite e mantenere le cellule in completa MEM nel 5% di CO ₂ a 37 ° C.
7. Preparazione di 5x DMEM
   1. Preparare 5x DMEM sciogliendo 13,4 g di polvere DMEM e 3,7 g di bicarbonato di sodio in 150 ml di acqua distillata sterile. Regolare il pH del terreno a 7,3, portare al volume di 200 ml e filtrare utilizzando 0,22 micron filtro a membrana. Raccogliere il mezzo filtrato in un contenitore sterile e conservato fino al momento dell'uso a RT.

2. Preparazione di fibroblasti Collagene-integrati

1. Scongelare aliquote congelate di FBS e L-glutammina in un bagno di 37 ° C Acque.Dopo lo scongelamento conservare i campioni in ghiaccio. Posizionare sodio bicarbonato (71,2 mg / ml) e gentamicina (50 mg / ml) a 4 ° C. Pre-cool 50 ml provette e pipette sterili 10 ml a 4 ° C.
   Nota: Tutti i materiali utilizzati (eccetto il 5x DMEM) sono raffreddati in ghiaccio prima dell'uso e tutte le fasi vengono eseguite su ghiaccio. Collagene di tipo I bovini (1,1 mg / ml) deve essere mantenuto freddo, come questo impedisce solidificazione del collagene.
2. Preparare i fibroblasti:
   1. Warm tripsina in un bagno d'acqua ° C 37 e incubare quantità sufficiente con fibroblasti polmonari (MRC-5), le cellule per 10 min a 5% di CO ₂ a 37 ° C. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 1x DMEM completo. Aspirare la sospensione cellulare e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 2,3 x 10 ⁵ cellule / ml in DMEM completo. Collocare le cellule in ghiaccio fino al momento dell'uso.
3. Preparare la pre-mix:
   1. Aggiungere il seguente in una provetta con l'etichetta "pre-mix"; 395ml di 5x DMEM, 40 microlitri L-glutammina, 120 microlitri NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 microlitri FBS, 5 ml Gentamicina (50 mg / ml), Volume totale 1.000 ml, quindi agitare la pre-mescolare bene e mettere su ghiaccio.
      Nota: I volumi indicati sono per un 24 millimetri 6-bene inserto cultura. Calcolare gli importi specifici richiesti per il numero totale di inserti, ma aggiungere un extra per essere sicuri, basta pre-mix è preparato.
4. Preparare la miscela di collagene acellulare:
   1. Per ogni cultura aggiungere 1 ml di miscela di collagene acellulare. Aggiungere il seguente ad un tubo conico da 50 ml su ghiaccio nell'ordine dato; 686 ml di 1,1 mg / ml di collagene, 250 microlitri premiscelazione e 64 microlitri 1x DMEM completo per un volume totale di 1000 ml. Mescolare bene la soluzione garantendo bolle d'aria. Lavorare velocemente e aggiungere il collagene sulla parete del tubo per evitare bolle d'aria.
   2. Aggiungere 1 ml della miscela strato acellulare all'inserto collocato nella piastra 6 bene. Non aggiungere qualsiasi supporto al pozzo esterno dell'inserto. Incubate per 30 minuti in un incubatore a 37 °. Assicurarsi che la miscela acellulare copre l'intero inserto senza bolle d'aria.
5. Preparare la miscela di collagene cellulare:
   1. Miscelare componenti dello strato cellulare in una provetta conica da 50 ml tenuti in ghiaccio nel seguente ordine; 2 ml di collagene, 615 ml di pre-mix, 58 ml di 1x DMEM completo e 327 ml di sospensione cellulare fibroblasti polmonari (MRC-5) per compensare il volume totale a 3.000 ml. Ogni cultura richiede 3 ml di miscela di collagene cellulare.
      PUNTO CRITICO: Assicurarsi di mescolare il collagene e premiscelato attentamente prima aggiunta della sospensione cellulare. Ciò neutralizzare il pH del collagene per evitare effetti tossici sui fibroblasti.
   2. Aggiungere lo strato cellulare (3 ml) al di sopra dello strato di collagene acellulare e incubare per 2 ore in un incubatore a 37 °. Lavorare velocemente e aggiungere il collagene sulla parete del tubo per evitare bolle d'aria.
   3. A seguito di polimerizzazione, aggiungere 2 ml di DMEM completo a tegli inferiore della piastra 6 e (sotto l'inserto) e incubare per 24 ore.
      NOTA: Se la polimerizzazione non si è verificato, eliminare gli inserti piatto contenente la matrice di collagene e fibroblasti-start-daccapo. La causa più probabile è un errore in aggiunta o il volume non corretta di uno dei reagenti sopra elencati.

3. Cultura continuo della Matrix Fibroblast collagene

1. Sollevare delicatamente l'inserto utilizzando una pinza pulita e aspirare il mezzo di coltura dal fondo del pozzo. Aggiungere 2 ml DMEM completo al fondo del pozzo seguito da 2 ml DMEM completo all'interno dell'inserto. Evitare l'introduzione di bolle d'aria sotto l'inserto, in modo da evitare la diffusione di nutrienti tra le camere esterne ed interne. Rimuovere le bolle d'aria con una punta micropipetta.
2. Modificare il terreno di coltura (dentro e sotto l'inserto) ogni due giorni e la cultura per circa 5-7 giorni. Fare attenzione nel rimuovere il supporto dal inserto. Per evitare contact con la matrice fibroblasti-collagene, inclinare leggermente l'inserto utilizzando una pinza pulita e aspirare i media dalle pareti dell'inserto.
   PUNTO CRITICO: I fibroblasti della matrice di collagene dovrebbe ottenere un fenotipo allungata, e rimodellare il collagene, che poi i contratti. In circa 5-7 giorni, la matrice ha contratto per formare una piattaforma (10-14 mm di diametro) al centro dell'inserto. La matrice contratta è pronto per l'uso nella fase successiva. Per ottenere una contrazione uniforme della matrice è fondamentale che i fibroblasti sono ben miscelati con il collagene prima semina (Fase 2.6.1).

4. Semina delle cellule immunitarie (Infected / non infetti Monocita-macrofagi Miscela)

Nota: Le seguenti operazioni sperimentali implicano micobatteri virulenti e, pertanto, devono essere eseguite in una struttura BSL-3.

1. Preparazione dei monociti e macrofagi primari:
   1. Isolare monociti del sangue periferico da donatore di sangue utilizzando un isticapannone protocollo. Isolare monociti nello stesso giorno come la creazione di modello e la cultura dei tessuti e li differenziarsi in macrofagi per circa 7 giorni prima infezione da M. la tubercolosi.
      NOTA: Questo garantirà sia i macrofagi e la matrice di collagene dei fibroblasti-contratto sono disponibili dopo 7 giorni. Isolare anche monociti freschi che verranno aggiunti insieme con i macrofagi infetti.
2. Preparazione di M. tubercolosi -infected macrofagi
   1. Raccogliere i batteri in coltura, lavare con PBS 1x contenente lo 0,05% di Tween-80, risospendere in-antibiotico libera DMEM completo, passano attraverso un tronco di sterili 27 ago G per disperdere grumi batteriche e misurare la densità ottica.
      Nota: pre-determinare la M. tuberculosis formanti colonia equivalenti unità di densità ottica in laboratorio. Questo darà una stima del numero di batteri da utilizzare per l'infezione.
   2. Incubare le macrofagi per 4 ore con M. tubercolosi molteplicità di infezione (MOI) 10). Dopo l'infezione, lavare 3x con PBS 1x per rimuovere i batteri extracellulari. Utilizzare macrofagi infettati coltivate nello stesso modo ma senza M. tuberculosis, come controlli.
   3. Staccare i macrofagi dalla piastra di coltura mediante trattamento con EDTA 2 mM per 10 min a 37 ° C e risospese le cellule in DMEM privo di antibiotico completo.
3. Etichettatura dei monociti
   Nota: Isolamento e etichettatura dei monociti possono essere eseguite in panchina BSL-2 e poi prese in BSL-3 impianto per l'ulteriore elaborazione.
   1. Stain monociti preparate (2 x 10 ⁷ cellule) con una concentrazione finale di 2 mM PKH26 colorante rosso per 5 min, secondo le istruzioni del produttore. Lavare 3x e risospendere le cellule con DMEM senza antibiotico completo ad una densità di 1 x 10 ⁷ cellule / ml.
4. L'aggiunta di cellule immunitarie di fibroblasti di collagene matrice
   1. Laopo 5-7 giorni di coltura della matrice fibroblasti-collagene, aspirare terreni di coltura dalle camere esterne ed interne e aggiungere 1,5 ml di DMEM fresco privo di antibiotici completo alla camera esterna.
   2. Preparare una monociti-macrofagi etichettati (infetti infetti /) miscela con un rapporto di MO: MQ (5: 1) in 50 microlitri DMEM completo. Per 50.000 macrofagi, monociti prendere 250.000 etichettati.
   3. Aggiungere 50 microlitri MO: miscela MQ alla matrice fibroblasti-collagene e incubare per 1 ora a 5% di CO ₂ a 37 ° C. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di coltura nell'inserto e incubare per altre 24 ore in 5% di CO ₂ a 37 ° C.
      Nota: Poiché le cellule aggiunte sono vagamente collegati, aggiunta dei media dovrebbe essere lento aggiungendo delicatamente sulle pareti dell'inserto.

5. Semina delle cellule epiteliali del polmone (16HBE)

Nota: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una struttura BSL-3.

1. Seed polmone ecellule pithelial (16HBE) sulla parte superiore del MO: MQ-fibroblasti-collagene strato. Per eseguire questa, prima dissociarsi 16HBE cellule dal pallone trattando con tripsina (come al punto 2.2.1.) E risospendere a 4 x ¹⁰ 6 cellule / ml in DMEM-antibiotico gratuito.
2. Aspirare il mezzo di coltura all'interno e all'esterno dell'inserto. Poi aggiungere 1,5 ml DMEM senza antibiotico completo nel fondo del pozzo esterno dell'inserto.
3. Aggiungere 50 ml di 16HBE sulla parte superiore della cella-fibroblasto immunitario matrice di collagene. Lasciare agire per 2 minuti nella cappa e incubare per 1 ora a 37 ° C incubatore con 5% di CO _2. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di DMEM senza antibiotico completo all'interno dell'inserto e coltura a 37 ° C per 3 giorni. Il passo coltura facilita la proliferazione delle cellule epiteliali del modello di tessuto.
   Nota: Come cellule aggiunte sono debolmente attaccati, aggiunta di media dovrebbe essere lento e delicato facendo scorrere attraverso le pareti dell'inserto.

6. Aria esposizione del polmone 3DModello

Nota: Dopo il giorno 5 dopo aggiunta di macrofagi infetti, i modelli di tessuto sono dotate di aria esposte e le seguenti operazioni devono essere eseguite in una struttura BSL-3.

1. Aspirare il mezzo di coltura all'interno e all'esterno dell'inserto.
   Nota: In questa fase surnatanti possono essere raccolti per la rilevazione dei fattori secreti. Centrifuga, sterile filtro e conservare supernatanti a -70 ° C.
2. Aggiungere 1,8 ml DMEM privo di antibiotici completi nella camera esterna e incubare in _5% CO 2 a 37 ° C incubatore per 2 giorni. Non aggiungere la cultura dei media all'interno dell'inserto.
   NOTA: Air-sollevamento del modello di tessuto facilita la formazione di epiteli stratificati e secrezione di muco, che fornisce la forza per il tessuto e somiglianza fisiologica al tessuto polmonare umano.

7. Raccolta e Montaggio del tessuto Modello 3D Polmone

Nota: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una struttura BSL-3.

1. Il giorno 7 dopo l'impianto di macrofagi infetti, i modelli di tessuto sono pronte per la raccolta. Rimuovere i terreni di coltura interamente dal modello di tessuto. Fissare il modello di tessuto con 4% paraformaldeide per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Questo passaggio uccide i batteri e corregge la morfologia dei tessuti / delle cellule per ulteriori elaborazioni.
2. Usando un bisturi, separare la membrana dall'inserto bene. Trasferire la membrana contenente il tessuto ad un pozzetto contenente PBS 1x.
3. Tagliare e rimuovere i lati del modello di tessuto con un bisturi pulito. Poi tagliare il modello di tessuto in 4 pezzi quadrati approssimativamente uguali. Trasferire un pezzo di tessuto su un vetrino SuperFrost. Conservare i pezzi di tessuto in 1x PBS a 4 ° C.
4. Asciugare il tessuto per 5 minuti e montare usando prolungare oro antifade con DAPI e vetrino. Lasciare le diapositive senza disturbare al buio a temperatura ambiente fino a secco.
   Nota: Lo spessore del tessuto può variare tra il centro e la periferia, che potrebbe causare lievi Tilting del vetrino. Per evitare questo, un distanziatore (per esempio parafilm) può essere posizionato in un angolo del vetrino.
5. Applicare lo smalto ai bordi del vetrino e lasciarlo asciugare. Immergere i vetrini in etanolo al 70% per renderli sicuri per portare fuori dalla struttura BSL-3.

8. Visualizzazione, acquisizione e analisi quantitativa 3D

1. Visualizzare i vetrini di tessuto usando un microscopio confocale con sistema laser che emettono rispettivamente a 488 nm per l'eccitazione di GFP (canale verde), 420 nm per DAPI (blu) e 555 nm per i monociti PKH26 marcati (rosso).
2. Acquisire immagini 3D ad una risoluzione di 512x512 con Z-stack copre almeno dello spessore di 20 micron e avente 1 - 1.5 micron separazione tra pile. Acquisire 5-10 diversi settori che coprono l'intero pezzo di tessuto.
   Nota: Utilizzare la configurazione come Nyqvist per le impostazioni ottimali di risoluzione ottica (lunghezza d'onda, laser di potenza / esposizione, dimensione dei pixel e zoom). Evitare under o sopra la saturazione dei pixel.
3. Analizzare le immagini confocale con il software di elaborazione delle immagini 3D. Per 3D quantificazione dei gruppi di cellule, i seguenti passaggi sono consigliati per l'analisi ottimale.
4. Aprire il software di elaborazione delle immagini 3D e caricare l'immagine. Misurare le dimensioni degli oggetti da analizzare nell'immagine, per esempio, le dimensioni di un nucleo, monociti individuale e singoli batteri. Queste osservazioni sono utili per la definizione o il filtraggio degli oggetti.
5. Utilizzando uno strumento di regolazione del display, ottimizzare volume rendering regolando ciascun canale per contrasto, la luminosità e si fondono l'opacità. Questo passaggio è quello di minimizzare l'interferenza di rumore in volume rendering.
   Nota: correzione gamma può portare alla manipolazione delle immagini e, quindi, dovrebbe essere evitato.
6. Creare superfici scegliendo il canale rosso (monociti) e impostare la soglia (selezione automatica o manuale). Se necessario, utilizzare filtri per limitare la selezione dei monociti rosso o escludere la background. Analogamente, per creare superfici verde (M. tuberculosis) e blu (nuclei) canali come descritto sopra.
7. Esportare i dati in file Ms-Excel. È possibile esportare un particolare parametro o tutti i dati. I parametri che sono rilevanti per l'analisi dei cluster cellulare sono di volume, intensità, numero di oggetti, numero di voxel e sfericità.
8. Salvare ed esportare le immagini in un formato immagine adatto preferibilmente TIFF.
   NOTA: Le animazioni può essere fatta anche utilizzando il menu di animazione e salvato come un file multimediale.
9. Salvare le impostazioni di analisi di ciascun canale utilizzando l'opzione Add parametri e può essere recuperato in seguito usando la funzione Ricostruisci. Contemporaneamente analizzare più file utilizzando lo strumento di elaborazione in batch.
   Nota: Le immagini da confrontare devono essere acquisiti, elaborati e analizzati allo stesso modo. Per esempio un immagine a 8 bit (256 intero) non deve essere confrontata un'immagine a 12 bit (4096 intero) con.

Risultati

Un modello di tessuto polmonare 3D per la tubercolosi umana può essere efficacemente utilizzato per studiare le interazioni ospite-patogeno a M. tubercolosi. Le operazioni di base di questo metodo, immagini rappresentative microscopiche di diversi passi e una struttura microscopica generale di una sezione di tessuto sono illustrate in Figura 1. Il modello ha diversi componenti del tessuto polmonare umano, compresi fibroblasti, cellule epiteliali bronchiali e monociti primari / macrofagi incorporato nell'ambiente tessuti 3D. Oltre che incorporano componenti del tessuto polmonare umano, il modello assomiglia condizioni fisiologiche e cioè la stratificazione degli epiteli e secrezione di muco.

Un esempio per l'uso del modello tessuto polmonare nel monitoraggio un'infezione TB è presentato in figura 2. Per visualizzare il M. tubercolosi migrazione cellulare -immune e interazione, abbiamo introdotto i macrofagi infettati con M. tubercolosi che esprimono GFP(verde), insieme con i monociti PKH26 marcati appena isolate (rosso) nel modello di tessuto (blu, DAPI macchiato per nuclei). Il giorno 7 dopo l'aggiunta di M. tubercolosi cellule -infected al modello di tessuto, microscopia confocale rivela il clustering dei monociti rossi al sito di infezione (verde) (Figura 2), che imita le lesioni segno distintivo di tubercolosi umano ^9.

Una serie di immagini rappresentative per la visualizzazione 3D di M. tubercolosi -infected modello di tessuto e la quantificazione di gruppi di cellule è illustrato nella figura 3. La visualizzazione 3D offre la flessibilità all'utente di interagire, di esaminare e quantificare diverse funzionalità in un'immagine 3D. La disposizione spaziale dei batteri verde e cluster monociti rosso può essere visto dalla vista apicale, rotazione e laterale come illustrato in figura 3B, che rivela raggruppamento di monociti nel sito di M. tubercolosi. I cluster non erano observito in tessuti non infetti (Figura 3A). Abbiamo quantificato il formato e il numero di gruppi di cellule monociti e trovato che la dimensione (volume) di gruppi di cellule è aumentata (p <0,001), mentre il numero di singoli monociti diminuita (p <0.01) in M. tubercolosi tessuti infetti rispetto ai modelli di tessuto non infetti (Figura 3C e 3D). Questi dati conferma la nostra precedente scoperta della formazione di granulomi presto in M. infezione tubercolare osservato in modelli tessuto polmonare analizzati nelle sezioni di tessuto 2D ^9.

I nostri dati suggeriscono che il modello di tessuto fornisce un habitat naturale per indagare 3D all'host complesso cellulo M. rete di comunicazione tubercolosi. Abbiamo anche trovato che la visualizzazione 3D e l'analisi quantitativa sono strumenti migliori per studiare le caratteristiche del modello di tessuto (Figura 3). Quantificazione di un cluster di cellule (granuloma per esempio) spesso stretc hes a diversi strati cellulari e possono essere completamente catturato da un'analisi quantitativa 3D. Inoltre, la visualizzazione delle caratteristiche precise spaziali e temporali di singole celle o batteri nel modello permette studi di live-imaging migrazione e di monitoraggio in un laboratorio designato.

Figura 2. monociti nel modello di tessuto di cluster intorno virulenta M. la tubercolosi. immagini confocali rappresentativi di non infetti e M. tubercolosi modello di tessuto infetto è presentato. I pannelli dal verde (M. da tubercolosi GFP), rosso (monociti PKH26 marcato), blu (nuclei DAPI-colorati) e canali uniti mostrano il reclutamento dei monociti nel tessuto infetto rispetto ai tessuti non infetti. Scale - 100 micron.large.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Visualizzazione 3D e analisi quantitativa di modello di tessuto forniscono informazioni utili. Immagini rappresentative della visualizzazione 3D di tutto il modello di tessuto (A) del tessuto infetto, (B) infettati con M. la tubercolosi, attraverso sezionamento ottico utilizzando Zeiss LSM700 microscopio confocale e analisi quantitativa dal software di elaborazione delle immagini Imaris (versione 7.6.8). Queste immagini sono state acquisite a 20 ingrandimenti, 14 z-stack coprono uno spessore di 19,5 micron tessuto con 1,5 micron intervallo, permettendo la visualizzazione da apicale, orizzontale di rotazione, vista verticale e laterale di rotazione (A e B). (C) Quaanalisi ntitative di gruppi di cellule monociti rivelano migliorata (p <0,0001) formato dei primi grappoli di granulomi dopo M. infezione tubercolare quando confrontato con assenza di infezione. (D) Quantificazione del numero dei monociti mostrato un calo (p <0.01) nel tessuto infetto rispetto al tessuto non infetto, ribadendo più cluster nel tessuto infetto. Verde - M. la tubercolosi-GFP, Rosso - monociti PKH26-etichettati, Blu - nuclei delle cellule, Scala -. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

La capacità di reclutare e formare gruppi cellulari organizzati nel sito di infezione è il segno distintivo della TB ¹¹ umana. Queste strutture dinamiche note come granulomi tubercolari sono costituite principalmente da cellule immunitarie (macrofagi, monociti, cellule T e cellule B) e cellule giganti multinucleate che circondano M. tuberculosis. Il ruolo del granuloma è stato a lungo considerato quello di bloccare l'infezione, prevenendo la diffusione locale dei batteri. Tuttavia, studi più recenti dimostrano che la formazione di granulomi è fondamentale per la sopravvivenza, la crescita e la diffusione precoce ^{dei batteri 12}. Una strategia di nuovi studi consiste nell'identificare molecole o percorsi che potrebbero essere efficacemente mirati per inibire la migrazione cellulare nella formazione del granuloma e/o nella disseminazione della TBC.

Un avvertimento per i nuovi studi sulla tubercolosi è la mancanza di modelli che ricapitolino la tubercolosi umana. Gli animali da esperimento più utilizzati non formano un vero granuloma in seguito all'infezione da M. tuberculosis e quindi non sono scelte appropriate per gli studi sulla TB ^13-16. I primati non umani hanno la somiglianza più stretta con la TB ¹⁷ umana, ma non sono la scelta preferita a causa degli elevati costi operativi e delle questioni etiche. La tubercolosi umana è un processo immunologico complesso ed è difficile da modellare in vitro. Le colture cellulari di monostrati o co-colture mancano dell'ambiente 3D e delle risposte tissutali. Pertanto, abbiamo sviluppato un modello innovativo di tessuto polmonare basato su cellule immunitarie primarie umane e linee cellulari specifiche per il polmone umano ^8,9. Il modello mostra le caratteristiche del tessuto polmonare umano, tra cui epiteli con macrofagi uniformemente integrati, formazione di matrice extracellulare, epiteli stratificati e secrezione di muco ⁹.

Il modello 3D di tessuto polmonare umano presenta diversi vantaggi rispetto alle colture singole o co-colture in vitro seminate su piastre di coltura tissutale o inserti transwell. In primo luogo, le cellule specifiche del polmone umano (fibroblasti e cellule epiteliali) non sono comunemente incluse nelle colture singole o co-colture in vitro . In secondo luogo, le cellule immunitarie e le cellule specifiche del polmone sono incorporate in un contesto fisiologico 3D (prodotti a matrice extracellulare ricchi di collagene). La risposta delle cellule a uno stimolo/infezione e il comportamento migratorio delle cellule, ad esempio la formazione di un granuloma, differiscono significativamente tra un ambiente 2D e 3D. Inoltre, il metodo descritto consente la visualizzazione 3D e una robusta analisi quantitativa 3D che fornisce informazioni fondamentali sulla distribuzione spaziale e sulle complesse interazioni cellulari.

L'infezione sperimentale nel tessuto modello con M. tuberculosis ha provocato un raggruppamento di macrofagi nel sito di infezione, che ricorda il granuloma precoce della TB (Figura 2 e 3). Abbiamo recentemente dimostrato che i ceppi mutanti difettosi nella capacità di secernere il fattore di virulenza ESAT-6 o Mycobacterium bovis BCG privo di ESAT-6 non inducono il raggruppamento di monociti (nessun granuloma precoce), in contrasto con il virulento M. tuberculosis ⁹. Questi dati sono coerenti con le osservazioni effettuate da embrioni di zebrafish infetti da Mycobacterium marinum, la cui trasparenza consente un'elegante imaging dal vivo della formazione del granuloma ¹². Poiché non esiste un modello gold standard per la tubercolosi, abbiamo sfruttato le biopsie tissutali resecate chirurgicamente da pazienti affetti da tubercolosi per convalidare il metodo ⁹. Il nostro modello tissutale in vitro condivide diverse caratteristiche con le biopsie polmonari e linfonodali di pazienti affetti da tubercolosi, tra cui l'aggregazione di macrofagi nel granuloma, la presenza di batteri sia intracellulari che extracellulari ¹⁸ e l'induzione della necrosi ¹¹.

Sebbene il modello descritto abbia rilevanza fisiologica per la tubercolosi umana e presenti diversi vantaggi rispetto ad altri modelli in vitro , presenta alcune limitazioni. Ad esempio, su più di 20 proteine del collagene identificate nell'uomo, solo il tipo I è incluso nel modello per imitare la matrice extracellulare. Tuttavia, il collagene di tipo I è una miscela complessa di prodotti a matrice extracellulare ed è il collagene più abbondante nel corpo umano. Inoltre, abbiamo dimostrato la presenza di collagene IV e di diverse proteine della matrice extracellulare come la tropoelastina, la vimentina e la laminina, che sono prodotte dalle cellule epiteliali e dai fibroblasti nel modello tissutale, indicando la sintesi di nuovo collagene ⁸. Attualmente, il modello di tessuto polmonare ha solo monociti e macrofagi, oltre alle cellule specifiche del polmone. Manca di neutrofili e linfociti che sono noti anche per essere presenti nel granuloma. Sorprendentemente, il modello non si limita all'introduzione di ulteriori cellule immunitarie ed è interessante per esplorare come esse contribuiscano alle complesse interazioni cellulari nella tubercolosi umana. L'impianto di macrofagi alveolari primari, cellule specifiche della pelle e cellule di carcinoma polmonare è già stato testato nel modello. Poiché il nostro obiettivo era quello di utilizzare un modello che assomigliasse molto alla tubercolosi umana, l'introduzione di cellule di topo non è stata tentata.

In sintesi, il modello di tessuto polmonare ha implicazioni sia per gli studi meccanicistici di base che per quelli applicati. Le potenziali applicazioni del modello polmonare includono lo studio dell'immunità innata, lo studio degli aspetti meccanicistici delle difese dell'ospite come la maturazione fagosomiale, l'autofagia, la produzione di citochine, chemochine e peptidi antimicrobici e la caratterizzazione funzionale di singoli tipi di cellule. Sorprendentemente, il modello tissutale in vitro consente la manipolazione di uno o più tipi di cellule e fornisce un microambiente tissutale rilevante, non solo per gli studi sulla tubercolosi, ma per una varietà di malattie infettive e non infettive che colpiscono i polmoni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inserti per colture cellulari	BD Falcon	353092
piastre di coltura a 6 pozzetti	BD Falcon	353046
cellule MRC-5, fibroblasti polmonari			ATCC#CCL-171
cellule 16HBE, cellule			Dono del Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, Università della California, San Francisco, USA
5 x Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (5 x DMEM)	Gibco	12800-082	Realizzato in polvere ma con l'aggiunta di 5 volte meno acqua. Regolare il pH a 7,3 e filtrarlo con un 0,2 µ m filtro.
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium con glucosio (DMEM) 1x	Gibco	41965-039
Minimum Essential Medium (MEM) 1x con Earle' s sali	Sigma	M4655
Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100x	Life Technologies	11140-035
L-glutammina 200 mM (100x)	Gibco	25030-024
Piruvato di sodio	Life Technologies	11360-039
NaHCO3 (71,2 mg/ml)			Preparato in casa
Siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS)	Gibco	10270-106	Calore inattivato per 30 min, 56 ° C
Gentamicina (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Hepes soluzione tampone 1M	Gibco	15630-056
Penicillina Streptomicina (Pen Strep)	Gibco	15140-122
Lymphoprep	Axis-Shield	7801
Ultrapure 0.5 M EDTA	Gibco	15575
Collagene bovino trattato PA (500 ml)	Organogenesi	200-055
Soluzione di collagene bovino purificato da col puro (100 ml)	Biomatrice avanzata	5005-B
Proteina della matrice extracellulare, Fibronectina (1 mg)	BD	354008
Monociti/macrofagi			Isolato da sangue intero umano o buffy coat.
PKH26 Linker cellulare fluorescente rosso	Sigma	MINI26
Mycobacterium tuberculosis H37Rv che esprime la proteina			fluorescente verde M. tuberculosis H37Rv wild type è stato trasformato con il plasmide pFPV2 che esprime costitutivamente GFP.
Middlebrook 7H9 medio	Difco	271310
BBL Middlebrook ADC Arricchimento	BBL	211887
Tween-80
Glicerolo
Kanamicina B solfato (20 &; g/ml)	Sigma	B5264
Reagente anti=-fade Prolong Gold con DAPI	Invitrogen	P36935
Tripsina -EDTA
Albumina
Paraformaldeide
DAPI
LSM700 Microscopio confocale	Zeiss
Software di elaborazione delle immagini 3D/4D iMaris Scientific, versione 7.6.8	Bitplane AG