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Articolo metodologico

Etichettatura delle cellule e Targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle

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DOI:

10.3791/53099

⸱

19 ottobre 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University, 4Regional Center for Applied Molecular Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, 5Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic

In questo articolo

Sommario

La somministrazione mirata di cellule è utile in una varietà di applicazioni biomediche. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPION) per marcare le cellule e quindi consentire approcci di targeting cellulare magnetico per un alto grado di controllo sulla consegna e la localizzazione delle cellule.

Abstract

Somministrazione mirata di cellule e agenti terapeutici a favore di un'ampia gamma di applicazioni biomediche concentrando l'effetto terapeutico al sito bersaglio, riducendo al minimo gli effetti deleteri a siti fuori bersaglio. Il targeting cellule magnetica è una tecnica di consegna efficiente, sicuro, e diretto. Nanoparticelle di ossido di ferro (superparamagnetic spion) sono biodegradabili, biocompatibili, e possono essere endocitosi in cellule di renderli sensibili ai campi magnetici. Il processo di sintesi prevede la creazione di magnetite (Fe 3 O 4) nanoparticelle seguita da emulsificazione ad alta velocità per formare una poli (lattico-co-glicolico) (PLGA) rivestimento. Le SPIONs PLGA-magnetite sono circa 120 nm di diametro compreso nucleo diametro magnetite circa 10 nm. Quando posto in terreno di coltura, SPIONs sono naturalmente endocitosi dalle cellule e memorizzati come piccoli cluster all'interno di endosomi citoplasmatici. Queste particelle impartiscono massa magnetica sufficiente per le celluleper consentire il targeting entro campi magnetici. Numerosi separazione delle cellule e applicazioni destinate sono attivati ​​per rendere vari tipi di cellule sensibili ai campi magnetici. SPIONs hanno una varietà di altre applicazioni biomediche e compreso l'uso come agente di contrasto imaging medico, farmaco o gene somministrazione mirata, saggi diagnostici, e la generazione di ipertermia locale per la terapia tumorale o saldatura del tessuto.

Introduzione

La consegna e la cattura mirate di cellule in siti specifici all'interno del corpo sono desiderabili per una varietà di applicazioni biomediche. La somministrazione di cellule staminali neurali al cervello mediante ultrasuoni focalizzati guidati dalla risonanza magnetica è stata proposta come possibile opzione di trattamento per le malattie neurodegenerative, le lesioni cerebrali traumatiche e l'ictus1. Le cellule staminali mesenchimali sono oggetto di studio per la loro capacità di somministrare farmaci antitumorali ai tumori grazie alle loro naturali proprietà tumorali-tropiche2,3. Le cellule staminali cardiache sono state somministrate al cuore come possibile trattamento per l'infarto del miocardio4,5. Gli stent vascolari sono stati sviluppati con anticorpi CD34 per catturare le cellule progenitrici circolanti6. Sebbene promettenti, questi approcci di targeting cellulare presentano inconvenienti, tra cui la mancanza di specificità cellulare, la ritenzione cellulare incoerente e la consegna di cellule fuori bersaglio.

L'obiettivo generale del metodo attuale è quello di consentire il targeting diretto magneticamente delle cellule per una varietà di applicazioni di consegna e smistamento delle cellule. Il puntamento magnetico consente la consegna controllata di cellule specifiche in un sito bersaglio specifico con effetti fuori bersaglio minimi7. I campi magnetici possono essere generati da dispositivi impiantati o esterni per dirigere in modo sicuro il movimento delle cellule marcate magneticamente all'interno del corpo8. Numerosi sforzi di ricerca si sono concentrati sul targeting diretto magneticamente delle cellule staminali su tessuti danneggiati come il cuore9-14, la retina15, il polmone16, la pelle17, il midollo spinale18,19, l'osso20, il fegato21 e il muscolo22,23 al fine di migliorare i risultati della rigenerazione.

Anche il targeting magnetico delle cellule è stato ampiamente studiato come mezzo per endotelizzare dispositivi cardiovascolari impiantabili. Un endotelio uniforme e completo fornisce una barriera tra il dispositivo e gli elementi del sangue circolanti per mitigare la trombosi e l'infiammazione. Le cellule endoteliali possono essere inviate al dispositivo prima dell'impianto o attraverso il sistema vascolare dopo l'impianto. In entrambi i casi, i campi magnetici vengono utilizzati per catturare le cellule sulla superficie del dispositivo e trattenere le cellule quando sottoposte allo stress di taglio generato dal sangue circolante. A tale scopo sono stati realizzati e testati gli stent vascolarimagnetici 24-27 e gli innesti vascolari28.

Il targeting delle celle magnetiche richiede una strategia per etichettare le cellule con particelle portatrici magnetiche. Queste particelle possono essere legate alla superficie delle cellule tramite anticorpi o coppie ligando/recettore oppure possono essere endocitose nelle cellule. Le nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPION) sono biodegradabili, biocompatibili e facilmente endocitose da una varietà di tipi di cellule29. Queste particelle rendono efficacemente una cellula reattiva ai campi magnetici e si degradano naturalmente nel tempo. Gli SPION forniscono un mezzo semplice e sicuro per marcare magneticamente le cellule in coltura per una varietà di applicazioni di targeting e smistamento magnetico. Viene fornito un metodo per sintetizzare gli SPION con un nucleo in magnetite (Fe3O4) e un guscio in acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA). Inoltre, viene fornito un metodo per marcare le cellule in coltura con SPION.

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Protocollo

1. Sintesi di magnetite Gel

  1. Lavare la vetreria con acido cloridrico concentrato seguita da acqua deionizzata seguita da alcool etilico. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente in un forno di essiccazione.
    ATTENZIONE! acido cloridrico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante; alcol etilico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale.
  2. Utilizzare una bottiglia di Drechsel di de-gas 500 ml di H 2 O deionizzata facendo gorgogliare delicatamente N 2 gas per 30 minuti.
  3. Set-up l'apparato di sintesi di magnetite all'interno di una cappa.
    1. Posizionare un pallone ml a tre colli a fondo tondo da 500 all'interno di un riscaldatore cuffia riscaldante e fissare il collo centro utilizzando una pinza e stand.
    2. Installare un setto di gomma in uno dei colli laterali del pallone a fondo rotondo e condensatore a riflusso con un setto di gomma nel collo lato rimanente. Continuamente scorrere acqua fredda attraverso il refrigerante a ricadere.
    3. Puntura °e setto di gomma del pallone a fondo tondo con un ago collegato ad una linea del gas N 2 e forare il setto di gomma del condensatore a riflusso con un ago collegato ad una linea di gas in esecuzione ad un gorgogliatore (cioè, matraccio con acqua) per visualizzare efflusso del gas.
    4. Installare una pala lama nel centro collo del pallone a fondo tondo tramite un adattatore pagaia. Attaccare albero della pala lama a un agitatore montato su un supporto.
  4. Spurgare il pallone a fondo tondo con N 2 gas e lasciare N 2 gas che scorre ad una velocità bassa ma rilevabile.
  5. Rimuovere il condensatore a riflusso del pallone a fondo tondo ed aggiungere 1.000 g di ferro (III) cloruro, 0,6125 g di ferro (II) cloruro tetraidrato, e 50 ml di degassati H 2 O.
    ATTENZIONE! di ferro (III) cloruro e ferro (II) cloruro tetraidrato sono nocivi - indossare dispositivi di protezione individuale.
  6. Sostituire il condensatore a ricadere e mescolare a 1.000 giri, mentre il riscaldamento a 50° C. Mescolando in queste condizioni produce 10 nm nanoparticelle di magnetite diameter.
  7. Una volta a 50 ° C, aggiungere 10 ml di soluzione di idrossido di ammonio 28% iniettando attraverso il tappo di gomma nel pallone a fondo tondo pur agitazione.
    ATTENZIONE! idrossido di ammonio è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale.
    NOTA: La soluzione di idrossido di ammonio è utilizzato per precipitare magnetite e la soluzione dovrebbe diventare nero.
  8. Rimuovere il setto di gomma e N 2 linea gas dal pallone a fondo tondo e calore a 90 ° C per evaporare l'ammoniaca gassosa mentre ancora agitazione.
    NOTA: È facoltativa per mantenere il flusso di N 2 nel pallone a fondo tondo perforando setto di gomma della condensatore a riflusso, tuttavia, l'ossidazione di magnetite per maghemite è trascurabile durante questa fase.
  9. Una volta a 90 ° C, aggiungere 1 ml di acido oleico nel pallone a fondo tondo pur agitazione. L'acido oleico è utilizzato per rivestire la magnetite nananoparticelle di per formare gel magnetite.
    ATTENZIONE! acido oleico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale.
  10. Sostituire il setto di gomma e N 2 linea del gas sul pallone a fondo tondo e rimuovere il refrigerante a ricadere.
  11. Spegnere il fuoco e mescolate a 500 rpm per 2 ore.
  12. Rimuovere il pallone a fondo tondo dal riscaldatore cuffia riscaldante e decantare il liquido in eccesso mentre usando un magnete forte tenuto contro il fondo del pallone di trattenere il gel magnetite.
    ATTENZIONE! gestire il forte magnete con estrema cura per evitare danni o lesioni.
  13. Lasciare che il gel di magnetite asciugare O / N (facoltativo).

2. Purificazione di magnetite Gel

  1. Aggiungere 40 ml di esano nel pallone a fondo tondo di sciogliere il gel magnetite
    ATTENZIONE! esano è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante.
  2. Utilizzare un imbuto separatore con 40 ml di de-gasati H 2 O per rimuovere residui di H 2 O from la soluzione magnetite.
    1. Versare lentamente la soluzione di magnetite sul H 2 O nel imbuto separatore e miscelare delicatamente il liquido in due fasi per 5 minuti.
    2. Scolare fuori e scartare la frazione acquoso inferiore.
    3. Aggiungere lentamente 40 ml di degassati H 2 O a imbuto separatore tale che si deposita sotto la soluzione magnetite e miscelare delicatamente e scaricare come prima.
    4. Ripetere per lavare per la terza volta.
  3. Trasferire la soluzione di magnetite di una beuta, aggiungere un paio di spatole per un valore di solfato di sodio anidro e agitare per rimuovere ogni residuo H 2 O residua dalla soluzione di magnetite.
  4. Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro magnetite 1 micron in un imbuto filtro per rimuovere il solfato di sodio e residua H 2 O.
    NOTA: è consigliabile farsi accompagnare vuoto.
  5. Trasferire la soluzione magnetite ad un pallone di evaporazione 50 ml e utilizzare un evaporatore rotante per evaporare l'esano per2 h con le seguenti condizioni: velocità di rotazione moderate, vuoto applicato, evaporando pallone in un bagno a 50 ° C di acqua, e 24 ° C l'acqua che circola attraverso il condensatore.
    NOTA: In alternativa, conservare il gel di magnetite prima del rivestimento con PLGA.

3. Rivestimento di magnetite di nanoparticelle con PLGA Shell

  1. Sciogliere 3,60 g di PLGA (75/25 blend) in 240 ml di acetato di etile per creare un (m / v) di 1,5%. ATTENZIONE: acetato di etile è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante.
  2. Sciogliere 25.00 g di Pluronic F-127 in 500 ml di degassati H 2 O con un agitatore magnetico per creare un (m / v) 5,0%.
    NOTA: Pluronic F-127 è un copolimero a blocchi anfifilo non ionico che agisce come un tensioattivo biocompatibile. Aiuta a stabilizzare l'emulsione olio-in-acqua nel passo 3.3.2.
  3. Utilizzando un microspatula, raccogliere il gel di magnetite in sei 0,040 g aliquote all'interno fiale di vetro ponderati. Perform il seguente processo di rivestimento e lavaggio per ciascuna aliquota.
    NOTA: Le aliquote sono necessari per garantire una gestione efficiente e decantazione magnetico, che consentirà di massimizzare purezza e resa, riducendo al minimo la degradazione prima di liofilizzazione al punto 4.
    1. Aggiungere a 0,040 g di gel un'aliquota magnetite e 40 ml della soluzione di PLGA in un beaker di plastica e sonicare in ultrasuoni per 10 minuti.
    2. Aggiungere 80 ml della soluzione Pluronic nel becher di plastica ed emulsionare immediatamente con un miscelatore da laboratorio al valore massimo per 7 minuti per formare il rivestimento PLGA sulle nanoparticelle di magnetite come una emulsione olio-in-acqua.
    3. Diluire immediatamente la soluzione Spion in 1 L di H 2 O deionizzata e ultrasuoni per 1 h in una cappa per evaporare l'acetato di etile.
    4. Posizionare un forte magnete accanto alla soluzione Spion e mescolare delicatamente per raccogliere SPIONs brunastre al magnete.
      NOTA: potrebbe essere necessario mescolare ad intermittenza per diverse ores prima che la soluzione diventa biancastra indicando che la maggior parte dei SPIONs sono stati raccolti.
    5. Decantare la soluzione acquosa, pur mantenendo le SPIONs nel bicchiere con il magnete.
    6. Lavare i SPIONs tre volte di seguito.
      1. Sospendere le SPIONs in 1 L di deionizzata H 2 O.
      2. Sonicare la soluzione Spion per 20 minuti.
      3. Posizionare un forte magnete accanto alla soluzione Spion e mescolare delicatamente per raccogliere SPIONs brunastre al magnete. Potrebbe essere necessario agitare intermittenza per diverse ore prima la soluzione diventa chiara indicando che la maggior parte dei SPIONs sono stati raccolti.
      4. Decantare la soluzione acquosa, pur mantenendo le SPIONs nel bicchiere con il magnete.
  4. Raccogliere le SPIONs sintetizzati da ciascuna delle sei aliquote gel magnetite in una singola fiala di vetro ponderata in sospensione acquosa. Opzionalmente decantare l'acqua in eccesso magneticamente, se necessario.

4. Fermo-Essiccazione di SPIONs

  1. Congelare la soluzione spion.
  2. Liofilizzare la soluzione Spion O / N in un liofilizzatore.
  3. Pesare i SPIONs liofilizzati. SPIONs liofilizzati possono essere conservati a -20 ° C fino al momento per l'etichettatura delle cellule.
    NOTA: Conservare a -20 ° C riduce drammaticamente cinetica di degradazione e aumenta la durata di conservazione.

5. Etichettatura di Celle con SPIONs

  1. Sospendere una aliquota di SPIONs in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 40 mg / ml e con ultrasuoni per 30 minuti.
  2. Aggiungere la soluzione in un pallone Spion quasi confluenti di cellule ad una concentrazione di 5 microlitri / ml di mezzo di coltura cellulare. Garantire una distribuzione uniforme agitandola lentamente il pallone.
  3. Incubare le cellule per 16 ore a 37 ° C.
  4. Aspirare delicatamente terreno di coltura e lavare le cellule due volte con PBS.
  5. Raccogliere le cellule magneticamente marcate e utilizzare per gli esperimenti.
  6. Soluzione spion non utilizzata può essere conservato a 4 ° C e dovrebbe essere noicato nel giro di pochi mesi. Con ultrasuoni per 30 minuti prima di ogni utilizzo.

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Risultati

Nanoparticelle di magnetite sono circa 10 nm di diametro a seguito di agitazione una soluzione acquosa di ferro (III) cloruro e ferro (II) cloruro tetraidrato a 50 ° C e 1.000 rpm (Figura 1). Questi risultati dimostrano riuscita sintesi di nanoparticelle di magnetite. È importante verificare la dimensione e la forma delle nanoparticelle di magnetite prelevati da un piccolo campione di batch quando si tenta la sintesi per la prima volta. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è il metodo preferito ...

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Discussione

Come con qualsiasi protocollo di sintesi di nanoparticelle, la purezza dei reagenti chimici è fondamentale per ottenere SPIONs alta qualità che avranno effetti citotossici minimi. È quindi importante per l'acquisto reagenti molto puri compreso l'acido oleico (≥99%), ferro (II) tetraidrato Cloruro (≥99.99%), ferro (III) cloruro (≥99.99%), acetato di etile (grado HPLC, ≥99.9% ), esano (grado HPLC, ≥97.0%), idrossido di ammonio (≥99.99%) e solfato di sodio (≥99.0%). È di particolare importanza per l'acquisto mo...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il finanziamento del Fondo Europeo di Sviluppo Regionale – FNUSA-CICR (n. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), l'American Heart Association Scientist Development Grant (AHA #06-35185N) e il National Institutes of Health (NIH #T32HL007111).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di idrossido di ammonio, 28% NH3 in H2O, ≥ 99,99% di tracce di metalloSigma-Aldrich338818-100ML Reagente nocivo: indossare dispositivi di protezione individuale
Flacone Dreschel, 500 mlAce Glass5516-16
Acetato di etile, CHROMASOLVR Plus, per HPLC, 99,9% Sigma-Aldrich650528-1LReagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare nella cappa aspirante
Alcool etilicoSigma-AldrichE7023Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale
Pallone di evaporazione, 50 ml, giunto 24/40Sigma-AldrichZ515558Per l'uso con rotoevaporatore
Carta da filtro, diametro 3 cm, grado 1Fisher09-805PDa utilizzare con l'imbuto filtrante in vetro
Becher in vetro, 1 LFisherFB-101-1000Per il lavaggio SPIONs
Imbuto filtrante in vetro, adattatore per tubo di aspirazione, adatto 24/40, 30 mLFisherK954100-0344 
Tappi per fiale di vetroFisher03-391-46Per l'uso con fiale di vetro Fiale
vetro, 2 mlFisher03-391-44Per la raccolta di gel di magnetite e SPIONs
Hesane, CHROMASOLVR, per HPLC, ≥ 97,0% (GC)Sigma-Aldrich34859-1L Reagente nocivo: indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare nella cappa aspirante
Acido cloridricoSigma-AldrichH1758Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in cappa aspirante
Cloruro di ferro (II) tetraidrato, ≥ 99,99% di metalli in tracce Sigma-Aldrich380024-5GReagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale
Cloruro di ferro (III) anidro, polvere, ≥ 99,99% di metalli in tracceSigma-Aldrich451649-1GReagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale
Riscaldatore Isomantle, 500 mLVoight GlobalEM0500/CEX1
Miscelatore da laboratorioSilversonL5M-A
LiofilizzatoreLabconco7670520
MicrospatoleFisher21-401-25APer il trasferimento di magnetite magnete
NdFeB in gel, 1 in x 1 in x 1 inmagneti sorprendentiC1000H-MMagnete molto forte, maneggiare con cura
acido oleico, ≥ 99% (GC)Sigma-AldrichO1008-5G Conservare in congelatore; Reagente nocivo - indossare dispositivi di protezione individuale
Agitatore ad astaIKA2572201
Morsetto per agitatore ad astaIKA2664000Per l'uso con agitatore ad asta
Agitatore ad asta H-standIKA1412000Per l'uso con agitatore ad asta
Soluzione salina tamponata con fosfatoLife Technologies10010-023
Becher in plastica, 250 mlFisher02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (miscela 75/25)PuracPDLG 7502PDLG 7502A può essere utilizzato pure; Conservare in
congelatore Pluronic F-127 in polvere, BioReagent, adatto per colture cellulariSigma-AldrichP2443-250G 
Paletta a pale espandibili in PTFE, diametro 8 mmSciQuipSP4018
, adatta a paletta 24/40, diametro 8 mmAdattatore perrecipiente in PTFE Monmouth Scientific A480Per l'uso con paletta a pale espandibili in PTFE
Refrigeratore a ricircoloClarkson696613Per l'uso con
, adatto a 24/40, 250 mmAce Glass5997-133
RotoevaporatoreClarkson216949
Setti in gomma, adatto a 24/40Ace Glass9096-56
Imbuto separatore con tappo, 250 mlFisher10-438E
Solfato di sodio ACS reagente, ≥ 99,0%, anidro, granulareSigma-Aldrich239313-500G 
Pallone a fondo tondo a tre colli, angolato, snodi 24/40, 500 mlAce Glass6948-16
Pulitore ad ultrasuoni piatto foratoFisher15-335-20APer l'uso con il pulitore ad ultrasuoni
Pulitore ad ultrasuoni, 2,8 LFisher15-335-20
Regolatore del vuotoClarkson216639Per l'uso con il rotoevaporatore (opzionale)
Vuoto pompaClarkson219959Per l'uso con rotoevaporatore
di Adattatore per recipiente in PTFE condensatore a riflusso rotoevaporatore

Riferimenti

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