Articolo metodologico

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

DOI:

10.3791/53225

⸱

11 novembre 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Keio University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive come generare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da cellule T periferiche umane in condizioni di feeder-free utilizzando una combinazione di vettori virali matrigel e Sendai contenenti fattori di riprogrammazione.

Abstract

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Recentemente, iPSCs hanno attirato l'attenzione come una nuova fonte di cellule per terapie rigenerative. Sebbene il metodo iniziale per iPSCs generano invocata fibroblasti dermici ottenuti mediante biopsia invasiva e retrovirali inserimento genomica di transgeni, ci sono stati molti sforzi per evitare questi inconvenienti. Le cellule T periferiche umani sono una fonte di cellule unico per la generazione di iPSCs. iPSCs derivati ​​da cellule T contengono riarrangiamenti del recettore delle cellule T (TCR) geni e sono una fonte di cellule T antigene-specifiche. Inoltre, T cell receptor riarrangiamento nel genoma ha il potenziale di etichettare linee di cellule individuali e di distinguere tra le cellule trapiantate e donatori. Per applicazione clinica sicura di iPSCs, è importante ridurre al minimo il rischio di esporre iPSCs appena generato ad agenti nocivi. Anche se le cellule di siero fetale bovino e di alimentazione sono stati fondamentali per la coltura di cellule staminali pluripotenti, è preferibile rimuoverli dal sistema di coltura per ridurre il rischiodi patogenicità imprevedibile. Per far fronte a questo, abbiamo stabilito un protocollo per la generazione di iPSCs dalle cellule T periferico umano mediante virus di Sendai per ridurre il rischio di esposizione agli agenti patogeni iPSCs indefiniti. Anche se la gestione Sendai virus richiede attrezzature con il livello di biosicurezza adeguato, virus infetta Sendai cellule T attivate, senza inserimento del genoma, ma con alta efficienza. In questo protocollo, dimostriamo la generazione di iPSCs dalle cellule T periferici umani in condizioni di assenza di alimentazione utilizzando una combinazione di attivo coltura delle cellule T e virus di Sendai.

Introduzione

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iPSCs hanno suscitato notevole attenzione come fonte innovativa di cellule per la medicina rigenerativa 1-3. Ad oggi, diversi metodi per la generazione di iPSCs sono stati segnalati 4,5. Tra questi, iPSCs generato da cellule T umane sono stati di particolare interesse a causa del metodo meno invasivo del campionamento delle cellule 6-8. Inoltre, iPSCs derivati ​​da cellule T contiene riarrangiamenti del gene del recettore delle cellule T (TCR) e sono quindi una fonte di cellule T antigene-specifiche 9,10. Pertanto, generando cellule derivate iPSCs T è sicuro utile per progredire la medicina rigenerativa.

Questo metodo si basa sul concetto di ridurre il rischio di patogenicità imprevedibile. Per applicazione clinica sicura di iPSCs è importante ridurre il rischio di esposizione ad agenti patogeni 11. Precedentemente in molti sistemi di coltura di cellule staminali pluripotenti, cellule di siero fetale bovino e alimentatore sono stati utilizzati come reagente essenziales 12. Tuttavia, la rimozione di entrambi questi reagenti del sistema di coltura è preferibile per la generazione COPSI per ridurre il rischio di patogenicità imprevedibile.

Inoltre, questo metodo ha il vantaggio di evitare il campionamento delle cellule invasive da pazienti e laboriosa preparazione di cellule feeder. Perché cellule T iPSCs derivati ​​sono già stati utilizzati con successo nella ricerca sulle malattie 13,14, questo metodo è applicabile e utile per generare iPSCs malattie specifiche da pazienti anche.

Tra i metodi di riprogrammazione delle cellule T, utilizzando il virus Sendai (SeV) vettore come veicolo gene è un metodo che può generare iPSCs con alta efficienza 7,16. Inoltre, poiché SeV è un singolo filamento RNA virus e non necessita di una fase di DNA per la replicazione, il suo uso nella generazione COPSI evita la rottura del genoma ospite 17-19. Pertanto, abbiamo stabilito protocolli per la generazione di iPSCs da cellule T periferico umano nel siero-frEE e condizioni senza alimentazione utilizzando una combinazione di matrigel, mTeSR media, e Sev vettori.

Protocollo

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1. Preparare cellule T attivate umana

  1. Raccogliere 10 ml di sangue intero eparinizzati da un donatore mediante prelievo venoso.
    1. Ottenere il consenso informato dei donatori in anticipo di prelievo venoso. Venipuntura deve essere effettuata da personale qualificato ed addestrato.
    2. Maneggiare i campioni di sangue ottenuti con materiale sterile e seguenti linee guida di biosicurezza adeguate.
  2. Diluire 10 ml di sangue intero eparinizzati con 10 ml D-PBS (-).
  3. Mettere 15 ml di soluzione di Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) in un nuovo tubo conico da 50 ml.
  4. Strato la soluzione di sangue da 20 ml preparata al punto 1.2 sulla soluzione di Ficoll al punto 1.3. L'utilizzo di un pipetta elettrico, della soluzione di sangue preparata al punto 1.2 correre lentamente lungo la parete interna del tubo. Fare attenzione a non mescolare la soluzione di sangue e la soluzione Ficoll.
  5. Centrifugare a 400 xg per 30 minuti a RT. Impostare la velocità di decelerazione centrifuga per "lento".
    Nota: Dopo la centrifugazione, un bianco sottilestrato emerge tra uno strato di plasma lattiginoso superiore e uno strato di Ficoll bassa chiara. Questo strato sottile bianca contiene cellule mononucleate.
  6. Trasferire lo strato di cellule mononucleate in una nuova provetta conica da 50 ml con una pipetta 1 ml. Fare attenzione a non includere la soluzione di Ficoll.
  7. Aggiungere D-PBS (-) per le cellule mononucleate ad un volume totale di 10 ml e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  8. Scartare il surnatante. Aggiungere 10 ml di D-PBS (-) alle cellule mononucleari, e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  9. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di KBM502 medio per le cellule mononucleate raccolti, e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Oltre 5 × 10 6 cellule mononucleari possono essere ottenuti da 10 ml di sangue intero eparinizzati con separazione appropriato utilizzando Ficoll.
  10. Preparare una soluzione di anticorpo CD3 anti-umano ad una concentrazione di 10 ug / ml in PBS-D (-). Aggiungere la soluzione di anticorpi anti-CD3 umana a una 6-pozzetti, immergere il surfasso di ogni pozzetto e incubare il piatto a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per almeno 30 min.
  11. Rimuovere la soluzione di anticorpi CD3 anti-umano da ciascun pozzetto e lavare una volta con PBS-D (-) appena prima semina delle cellule.
  12. Cellule mononucleate Seed che sono stati preparati nel passo 1.9 ad una densità di 2,5 x 10 5 cellule / cm 2 sui CD3 antiumano 6 pozzetti rivestiti con anticorpo in KBM502 media. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per 3-7 giorni senza mezzo di cambiamento fino a quando le cellule T raggiungono confluenza. Le cellule T in questo periodo sono sia le cellule in sospensione e aderenti.

2. Infettare T umano Celle con SEV Vettori

  1. Dopo 3-7 giorni la cultura, raccogliere le cellule T attivate con medio esistente pipettando. Trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo KBM502 fresco. Contare le cellule e la piastra 1.5 × 10 6 celle (in 2 ml di media KBM502 fresco) in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti anti-CD3 anticorpo-rivestito.
  3. Scongelare le soluzioni SEV di Oct3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, Klf4-SEV / TSΔF, e c-Myc (HNL) -sev / TS15ΔF sul ghiaccio.
  4. Aggiungere le soluzioni SEV contenenti Oct3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, Klf4-SEV / TSΔF, e c-Myc (HNL) -sev / TS15ΔF individualmente ai pozzi, ciascuna ad una molteplicità di infezione (MOI) 10. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per altre 24 ore.

3. Rimuovere Sev Vettori da T cellule umane

  1. 24 ore dopo l'infezione, raccogliere le cellule infettate con una pipetta. Se ci sono cellule aderenti, possono facilmente essere staccati li pipettando ripetutamente su e giù. Trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Eliminare il surnatante contenente i vettori Sev, e aggiungere 2 ml di mezzo KBM502 fresco. Cellule replate a each dei pozzetti. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per altre 24 ore.

4. Cellule reseed su uno strato Matrigel

  1. Preparare la soluzione di matrice membrana basale da gel matrice scongelamento (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) a 4 ° C e sciogliendo 0,2 ml in 10 ml di terreno DMEM / F12.
    Nota: Gel Matrix (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) deve scongelare O / N a 4 ° C per essere completamente scongelati. Tenerlo in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  2. Piatto soluzione matrice membrana basale 5 ml per piastra in piastre da 100 mm e lasciare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima della semina cellule. Almeno due piatti da 100 mm sono necessari per un esperimento.
  3. Raccogliere le cellule SEV-infettate pipettando, trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo KBM502 fresco. Contare il numero di cells con un emocitometro, rimuovere la soluzione di matrice membrana basale da piatti da 100 mm preparati nel passaggio 4.2 e piastra 1 × 10 5 e 1 × 10 6 celle (in 10 ml di media mTeSR fresco) su un 100 mm membrana basale matrice rivestita piatti. Infine, utilizzare la piastra in cui le colonie sono facilmente raccolti.
  5. Incubare il piatto a 37 ° C in 5% -CO 2 incubatore O / N.
  6. Cambiare il medio 10 ml di incarnarsi mTeSR medio a giorni alterni.
    Nota: Circa 20-30 giorni dopo l'infezione, colonie che ricordano da vicino le cellule staminali embrionali (ESC) apparirà.

5. Espandere T iPSCs derivati ​​dalle cellule

  1. Preparare la soluzione di matrice membrana basale da gel matrice scongelamento (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) a 4 ° C e sciogliendo 0,2 ml in 10 ml di terreno DMEM / F12.
  2. Piastra 1 ml di soluzione di matrice membrana basale per bene in un 6-pozzetti e lasciare a temperatura ambiente per un periodoalmeno 30 minuti prima di prendere colonie.
  3. Riempire una piastra a 96 pozzetti con 20 ml di mTeSR media per pozzetto.
  4. Selezionare colonie che assomigliano CES allo stereomicroscopio con una pipetta 20 ml.
    Nota: Le colonie di CES e iPSCs sono rotondi e piatta come mostrato in Figura 1B.
  5. Trasferire colonie selezionate nella piastra a 96 pozzetti pieni di mTeSR medie punto 5.3.
  6. Aggiungere 200 ml di mTeSR media ad ogni bene e con attenzione pipetta su e giù per rompere la colonia in piccoli ciuffi con lo stereomicroscopio con una pipetta 200 l. Rimuovere la soluzione di matrice membrana basale dalla ben preparato in 5.2 e mettere ogni colonia in un pozzetto della membrana basale matrice rivestite 6 pozzetti con 2 ml di mTeSR media per pozzetto.
  7. Cambiare il medio-2 ml di incarnarsi mTeSR medio a giorni alterni.

6. Mantenere T iPSCs derivati ​​dalle cellule

Le iPSCs derivati ​​dalle cellule T possono essere mantenutie memorizzati utilizzando le stesse tecniche per iPSCs umane e CES umani. Una volta che le colonie IPSC crescono, li espandersi in piatti più grandi ripetendo la stessa procedura.

  1. Cambia il mezzo mTeSR ogni 1-2 giorni.
  2. Quando le colonie diventano confluenti ogni 5-7 giorni, di passaggio le cellule utilizzando soluzione dissociazione per iPSCs umani e CES umani in base alle istruzioni del produttore.

Risultati

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Usando questo protocollo, gli utenti sono in grado di generare iPSCs dalle cellule T periferico umano stabile. generazione IPSC dalle cellule T con SeV e matrigel ha mostrato circa il 0,002% -. 0,005% di efficienza della riprogrammazione delle cellule tra diversi casi donatori e SeV non sono stati individuati dopo vari passaggi 16 Figura 1A mostra uno schema del protocollo per la generazione di cellule T-derivato iPSCs in condizioni di assenza di alimentazione con matrigel e mTeSR media. Intorno 20-30 giorni dopo l'infezione con SeV, colonie IPSC sono riconosciuti per la loro colonia ESC-come morfologia (Figura 1B). Immunofluorescenza rivela espressione di marcatori tipici delle cellule pluripotenti (Nanog, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) in iPSCs derivati ​​dalle cellule T ottenuti in condizioni di libero-feeder (Figura 1C).

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Figura 1. (A): Uno schema del protocollo di riprogrammazione delle cellule T in condizioni senza feeder in questo studio. (B): Una tipica colonia ESC-come IPSC il giorno 27 dopo il prelievo di sangue in condizioni di libero-feeder. (C): ALP colorazione e immunofluorescenza per pluripotenza e superficiali marcatori (Nanog, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) in iPSCs derivati ​​dalle cellule T in condizioni di libero-feeder. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Descriviamo un protocollo per la generazione di iPSC da cellule T periferiche umane in condizioni prive di siero e di feeder utilizzando una combinazione di vettori matrigel, terreno mTeSR e SeV. Per le applicazioni cliniche delle iPSC, è importante disporre di un protocollo per la generazione stabile di iPSC e di un metodo meno invasivo per il campionamento cellulare. Sebbene la generazione di iPSC con la combinazione di matrigel e terreno mTeSR abbia mostrato un'efficienza di riprogrammazione inferiore rispetto a quella con il terreno di sostituzione del siero knockout (KSR) e le cellule feeder, questa combinazione consente di ottenere una generazione stabile di iPSC dai donatori16. La generazione stabile di iPSC e il campionamento cellulare meno invasivo hanno il vantaggio di poter aumentare il numero di donatori per la generazione di iPSC.

I vettori SeV, un virus a RNA a filamento meno, non sono integrati nel genoma ospite. Pertanto, i rischi di tumorigenesi possono essere evitati nella fase di riprogrammazione dell'induzione del fattore20-24. Inoltre, le condizioni di assenza di alimentatore, che utilizzano una combinazione di terreno di coltura definito e matrigel invece di uno strato di alimentazione, consentono di ridurre al minimo i potenziali rischi di esposizione a fattori esogeni sconosciuti. La fusione di queste tecniche fornisce una tecnologia iPSC meno invasiva e più sicura per la medicina rigenerativa16.

Passaggi importanti in questo protocollo sono la fase di attivazione delle cellule T umane (Fase 1) e l'infezione con vettori SeV (Fase 2). Quando non si ottiene alcuna colonia simile all'ESC nella piastra di coltura in un momento ottimale dopo l'infezione da SeV, si deve considerare quanto segue. In primo luogo, la confluenza delle cellule mononucleate prima dell'attivazione delle cellule T potrebbe non essere appropriata perché l'attivazione ottimale delle cellule T è fondamentale per l'infezione da SeV25,26. Una densità troppo elevata di cellule mononucleate porta alla morte cellulare, interferendo con la corretta attivazione delle cellule T. Una densità troppo bassa di cellule mononucleate disturba anche la corretta attivazione e proliferazione delle cellule T. Pertanto, la confluenza delle cellule mononucleate deve essere controllata e regolata di conseguenza. In secondo luogo, il dosaggio dei vettori SeV potrebbe non essere sufficiente. L'efficienza di induzione delle colonie di iPSC dipende dal dosaggio del virus6. Se non si osserva alcuna colonia simile all'ESC dopo l'infezione da SeV, si deve prendere in considerazione l'opzione di aumentare il dosaggio del virus fino a un MOI di 15-20. Se si osservano segni di differenziazione delle colonie di iPSC, la frequenza con cui il terreno viene cambiato può essere aumentata fino a giorni alterni o a tutti i giorni in cui le colonie sono più grandi.

La limitazione di questo protocollo consiste nel fatto che questo metodo non è privo di virus. Sebbene SeV per la riprogrammazione cellulare sia disponibile in commercio con facilità, gli utenti devono preparare l'apparecchiatura in base al livello di biosicurezza appropriato. Come altro metodo per generare iPSC prive di integrazione, i vettori episomiali sono stati utilizzati fino ad ora27-29. Sebbene i vettori episomiali possano essere utilizzati con apparecchiature con un livello inferiore di biosicurezza, i vettori episomiali potrebbero inserirsi nel genoma dell'ospite a velocità estremamente basse. Pertanto, sono necessari ulteriori controlli per confermare la scomparsa dei transgeni, come quando si utilizza SeV.

C'è un altro limite in quanto questa tecnica non è assolutamente esente da prodotti di origine animale. Alcuni substrati, come il matrigel, gli anticorpi monoclonali anti-CD3, la soluzione di dissociazione e la soluzione di SeV sono derivati da prodotti animali e sono quindi associati a un rischio di trasferimento di patogeni xenogenici. Tuttavia, la riduzione dei substrati di origine animale nel sistema di coltura è significativa per l'applicazione clinica della tecnologia iPSC a causa del minor rischio.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno alcuna competizione o in conflitto gli interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, e Rei Ohno della scuola dell'università Keio di Medicina per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato da un programma di R & D Systems sostegno per accelerare l'uso pratico dei risultati della ricerca di salute, e il programma di strada per la realizzazione di Medicina Rigenerativa.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ficoll-Paque PREMIUMGE Healthcare17-5442-02
Purificato NA/LE topo anti-umano CD3BD Pharmingen555336
frazione di albumina bovinaGibco15260-037
mTeSR1 kit medioSTEM CELL5850Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso
Soluzione di dissociazioneReproCELLRCHETP002
D-PBS(–)Wako045-29795
Kit vettoriale SeV CytoTune-iPS ver.1.0DNAVECDV-0303cScongelare su ghiaccio prima dell'uso Piastra per
coltura tissutale da 100 mmFalcon353003
Piastra per coltura tissutale a 96 pozzettiFalcon353078
Piastra per coltura tissutale a 6 pozzettiFalcon353046
15  ml Provetta da centrifugaGreiner Bio-One188271
50  ml Provetta da centrifugaGreiner Bio-One227261
Soluzione V per

Riferimenti

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