Articolo metodologico

Isolamento fisico di Endospore da campioni ambientali da mirata Lisi di cellule vegetative

DOI:

10.3791/53411

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21 gennaio 2016

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1Department of Biological Sciences, Macquarie University, 2Vital-IT group, Swiss Institute of Bioinformatics, 3Laboratory of Microbiology, University of Neuchatel

In questo articolo

Sommario

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È stato sviluppato un metodo per individuare endospore batteriche da comunità microbiche complesse per eseguire colture su misura o studi molecolari di questo gruppo di batteri.

Abstract

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La formazione di endospore è una strategia di sopravvivenza che si trova tra alcuni batteri del phylum Firmicutes. Durante la formazione delle endospore, questi batteri entrano in uno stato di riposo morfo-fisiologico che migliora la sopravvivenza in condizioni ambientali avverse. Anche se i Firmicutes che formano endospore sono uno dei gruppi batterici più frequentemente arricchiti e isolati negli studi di coltura, sono spesso assenti dagli studi sulla diversità basati su metodi molecolari. La resistenza del nucleo di spore è considerata uno dei fattori che limitano il recupero del DNA dalle endospore. Abbiamo sviluppato un metodo che sfrutta la maggiore resistenza delle endospore per separarle da altre cellule in una complessa comunità microbica utilizzando metodi di lisi fisica, enzimatica e chimica. La preparazione di sole endospore così ottenuta può essere utilizzata per la ricoltura o per eseguire analisi a valle, come l'estrazione del DNA su misura ottimizzata per le endospore e il successivo sequenziamento del DNA. Questo metodo, applicato a campioni di sedimenti, ha permesso l'arricchimento di endospore e, dopo il sequenziamento, ha rivelato una grande diversità di formatori di endospore nei sedimenti lacustri d'acqua dolce. Ci aspettiamo che l'applicazione di questo metodo ad altri campioni produca un risultato simile.

Introduzione

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L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per la separazione di endospore batteriche da cellule batteriche vegetative in campioni ambientali. La formazione di endospore batteriche è una strategia di sopravvivenza, di solito innescato da inedia, trovato in un certo numero di gruppi di batteri appartenenti al phylum Firmicutes 1. Batteri che formano endospore sono ben studiati, soprattutto a causa di un numero di ceppi sono patogeni e quindi di importanza medica (per esempio, il Bacillus anthracis o Clostridium difficile). Ceppi ambientali di batteri che formano endospora sono stati isolati da praticamente ogni ambiente (suolo, acqua, sedimenti, aria, ghiaccio, intestino umano, gli animali intestino, e altro) 1-3. Pertanto, Firmicutes sono la seconda phylum più abbondante nel collezioni di colture 4.

A causa delle loro proteine ​​resistenti corteccia esterna e nucleo protettivo, endospore possono sopravvivere a condizioni ambientali estreme che vanno from essiccazione a radiazioni elevate, temperature estreme e sostanze chimiche nocive 5. Questo notevole resistenza lo rende una sfida per estrarre il DNA da endospore 6-8. Questo probabilmente spiega perché sono stati trascurati negli studi di sequenziamento ambientale 9,10. Altri metodi, come ad esempio il targeting di endospore in campioni ambientali da anticorpi fluorescenti 11, la quantificazione di acido dipicolinico (DPA) nel suolo e nei sedimenti 13 12, citofluorimetria 14 o la pastorizzazione e la successiva coltivazione 15,16 sono stati utilizzati per recuperare o quantificare endospores in campioni ambientali. Negli ultimi anni, metodi di estrazione del DNA ottimizzato così come primers molecolari specifici per indirizzare sequenze geniche specifiche endospora sono stati sviluppati 10,17-20. Ciò ha contribuito a rivelare di più la biodiversità tra questo gruppo di batteri 21 e ha portato anche ad applicazioni nell'industria e in medicina per il rilevamento di endospore, Per esempio in latte in polvere 19.

Il protocollo qui presentata si basa sulla differenza di resistenza alle condizioni fisico-chimiche nocive (quali calore e detergenti) di endospore batteriche relativi alle cellule vegetative. Per distruggere le cellule vegetative in un campione, noi applichiamo consecutivamente calore, lisozima e basse concentrazioni di detergenti. Il tempo e la forza di questi trattamenti sono stati ottimizzati in modo da non distruggere le spore, ma per lisare tutte le cellule vegetative. Alcune cellule in un pool di cellule ambientale sono più resistenti di altre, per cui al fine di aumentare la probabilità di distruggere tutte le cellule vegetative, si applicano tre diversi trattamenti. Il vantaggio e la novità di questo metodo è che i endospore dopo il trattamento sono ancora intatte e possono essere utilizzati per ulteriori analisi a valle. Questi includono l'estrazione del DNA, PCR quantitativa (qPCR) e amplicone o sequenziamento metagenomica (di mira in particolare il gruppo di endospore e riducendo diversity, aumentando la copertura). Le endospore potrebbero essere utilizzati anche per la coltivazione a valle o la quantificazione mediante microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, o il rilevamento di DPA. Una caratteristica importante di questo metodo è che confrontando un campione non trattato con un campione trattato, si può dedurre la quantità e la diversità di endospore in un campione ambientale, oltre alla componente corrispondente al vegetative cellule.

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Protocollo

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1. Preparazione di prodotti chimici e attrezzature

  1. Fare 500 ml di una esametafosfato di sodio all'1% (SHMP) (NaPO 3) n soluzione e sterilizzare in autoclave.
  2. Sterilizzare nitrocellulosa (NC) filtri (diametro dei pori 0,22 micron, 47 mm di diametro) in autoclave in vetro chiuso Petri.
  3. Sterilizzare filtri NC (dimensione dei pori di 0,22 micron, 25 mm di diametro) in autoclave in vetro chiuso piastre di Petri.
  4. Pesare e prendere nota del peso a vuoto di sterili provette da 50 ml (con tappo) (un tubo per campione).
  5. Preparare Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x: rendere la soluzione di 10 mM Tris (tris (idrossimetil) aminometano) e 1 tampone mM EDTA. Regolare il pH a 8 e sterilizzare in autoclave.
  6. Preparare la soluzione di lisozima (20 mg / ml) sciogliendo 0,02 g di lisozima in 1 ml di TE-buffer. Idealmente, fare fresco ogni volta. Conservare a 4 ° C per non più di 1 settimana.
  7. Preparare la soluzione fisiologica sciogliendo 8 g / l di cloruro di sodio(NaCl) in acqua distillata. Sterilizzare in autoclave.

2. Separazione di biomassa da sedimenti

  1. Aggiungere 3 g di campione di sedimento di pre-pesare sterili provette da 50 ml con palline di metallo etanolo fiammato. Eseguire questo in una, UV sterilizzata armadio biosicurezza pulito per evitare la contaminazione.
  2. Aggiungere 15 ml di una sterile (autoclave) Soluzione SHMP 1% al campione utilizzando una sterile buretta. La soluzione può SHMP inoltre il filtraggio per evitare la contaminazione.
  3. Omogeneizzare il sedimento e la soluzione SHMP con un dispersore liquido / omogeneizzatore (ad esempio, Ultra-Turrax omogeneizzatore). 70% di etanolo o sterilizzare in autoclave il rotore di dispersione prima dell'uso. Eseguire l'omogeneizzazione per 1 min a 17.500 rpm. Lasciare riposare campione per 2 minuti e ripetere l'omogeneizzazione per 1 min alla stessa velocità del rotore.
  4. Lasciate riposare il campione per 10 min. A questo punto, le particelle più pesanti (minerali) si sistemerà. Le cellule ei componenti organici del campione tuttavia wmalato rimangono in soluzione. Successivamente, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in una provetta pulita da 50 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet sedimento.
  5. Per il pellet sedimento aggiungere nuovamente 15 ml di una sterile (autoclave) Soluzione SHMP 1% con una sterile buretta. Poi ripetere i punti 2.3 e 2.4. Questa ripetizione assicura la separazione della quantità massima di cellule e particelle organiche dalla componente minerale del sedimento. Il supernatante di questa seconda separazione può essere fusa con il supernatante dal prima separazione.
    Nota: Le seguenti operazioni sono tutti fatti sul surnatante (contenente biomassa cellulare). La componente minerale (sedimenti pellet) può essere scartato.
  6. Centrifugare il campione a 20 xg per 1 min. Questo passaggio aumenta la forza g sufficiente per risolvere piccole particelle minerali mentre il materiale cellula biologica rimane in soluzione. Dopo centrifugazione, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in unpulito tubo da 50 ml. Eliminare il pellet minerale.
  7. Determinare il volume finale della soluzione contenente biomassa pesando il campione. La determinazione del peso evita di dover trasferire il campione ad un cilindro graduato e riduce il rischio di contaminazione.

3. Raccolta di biomassa su membrana filtrante

  1. Preparare unità di filtrazione (per 47 mm di membrane di diametro) e pompa del vuoto. Sterilizzare l'unità di filtrazione sia in autoclave o (se Pyrex vetro) spruzzando con il 70% di etanolo e fiamme con un becco Bunsen. Lasciate raffreddare prima di continuare con il protocollo.
  2. Aggiungere sterili membrana NC all'unità di filtrazione con pinze sterilizzate etanolo fiammato.
  3. Aggiungere metà del campione surnatante (dal punto 2.6) sul gruppo di filtrazione a membrana e raccogliere le cellule sulla membrana utilizzando la pompa a vuoto.
  4. Quando il liquido è completamente passata attraverso il filtro, arrestare la pompa per vuoto e rimuovere con cautela la membrana utilizzando ethanol-fiamma pinza sterilizzata. Posizionare la membrana in una piastra di Petri sterile.
    1. Tagliare la membrana a metà con le forbici sterilizzate etanolo fiammato. Aggiungere ogni metà della membrana su un tubo separato 2 ml. Una metà della membrana sarà utilizzata per l'estrazione del DNA e l'analisi dell'intera comunità batterica. L'altra metà del filtro sarà conservato a -80 ° C e serve come backup.
  5. Posizionare nuova membrana NC sul gruppo di filtrazione e raccogliere biomassa dalla seconda metà del volume del campione (dal punto 2.6) con la pompa a vuoto.
  6. Quando il liquido è completamente passata attraverso il filtro, arrestare la pompa per vuoto e rimuovere con cautela la membrana con pinze sterili etanolo fiammato. Posizionare tutta la membrana in un tubo separato 2 ml. Questo campione verrà utilizzato per il trattamento di separare endospore da cellule vegetative. Il campione può essere conservato a -20 ° C fino al momento dell'uso.

4. Lisi di cellule vegetative

  1. Eseguire latrattamento per separare endospore dalle cellule vegetative sulla biomassa precedentemente raccolto su una membrana NC (passo 3.6).
    1. Se la membrana è stato congelato, lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti per scongelare. Poi posto la membrana in una piastra di Petri sterile e tagliarlo (circa 4 volte) in pezzi più piccoli con le forbici sterilizzate etanolo fiammato. Poi posto tutti i pezzi del filtro a membrana in una provetta sterile da 2 ml.
  2. Aggiungere 900 ml di 1x TE (Tris-EDTA) Buffer (vedi 1.5) per il tubo contenente la membrana campione e mescolare accuratamente vortice. A questo punto, la biomassa viene rimosso dalla membrana nella soluzione TE-buffer.
  3. Porre il tubo in un incubatore a 65 ° C per 10 min e 80 rpm. Successivamente rimuovere il tubo dal termostato e lasciarlo raffreddare per 15 minuti.
  4. Aggiungere 100 ml di lisozima preparata di fresco (vedi 1.5) per ottenere una concentrazione finale di 2 mg / ml. Non aggiungere il lisozima prima che il campione è raffreddato a 37 ° C, in quanto questo potrebbe degRade l'enzima.
  5. Incubare il campione a 37 ° C per 60 min e 80 rpm, le condizioni ottimali per il lisozima di lisare cellule vegetative.
  6. Dopo lisi è completa, aggiungere 250 ml di idrossido di 3 N di sodio (NaOH) e 250 ml di soluzione al 6% sodio dodecilsolfato (SDS) al campione. Aggiungendo questo, il volume del campione raggiunge 1,5 ml e vi è una concentrazione finale di 0,5 N NaOH e concentrazione finale di 1% SDS.
  7. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 60 min e 80 rpm. Aggiunta la base e detergenti aiuterà nella lisi cellulare finale. La concentrazione di questi detergenti è stato ottimizzato per non danneggiare le endospore, mentre lisi cellule vegetative.
  8. Preparare un'unità di filtrazione sterile che contiene 25 mm di diametro membrane in autoclave, o (se Pyrex vetro) spruzzandolo con 70% etanolo e fiamme con un becco Bunsen. Lasciate raffreddare.
  9. Posizionare un NC membrana 0,2 micron (diametro 25 mm) in unità di filtrazione con pinze etanolo fiamma sterilizzati.
  10. Aggiungere il campione dal punto 4.7 sulla membrana e filtrare il liquido con la pompa a vuoto. Quando il liquido è passato attraverso, spegnere pompa a vuoto. A questo punto, il materiale cellula vegetativa lisato viene rimosso, in quanto non è trattenuto sulla membrana. Solo endospore rimarranno sulla membrana.
  11. Aggiungere 2 ml di soluzione fisiologica sterile per lavare detergenti residue e filtrare il liquido con la pompa a vuoto.
  12. Quando il liquido è completamente filtrato, spegnere la pompa del vuoto. Lasciare la membrana sul gruppo di filtrazione.

5. Il trattamento DNasi

Nota: eseguire il trattamento DNasi direttamente sulla membrana del filtro. È importante che l'unità di filtrazione non perde e la pompa a vuoto è spento.

  1. Aggiungere 450 ml di acqua sterile, 50 ml di tampone di reazione DNasi (1x) e 0,5 microlitri DNasi enzima direttamente sulla membrana del filtro e lasciar riposare per 15 minuti. Se possibile, fare questo digestione in una stanza che è un po 'di guerramer della media RT, poiché l'enzima funziona meglio a temperature di 25 ° C e oltre.
    Nota: Mantenere il becco Bunsen parte l'unità di filtrazione aumenta anche la temperatura e ha il vantaggio di mantenere le frazioni sterile, quindi ridotto rischio di contaminazione dei campioni.
  2. Quando la digestione DNasi è terminato, accenda la pompa del vuoto per rimuovere l'enzima dal campione.
  3. Lavare enzimatica residua aggiungendo e filtrando 1 ml di soluzione fisiologica.
  4. Se del liquido è completamente superato, spegnere pompa del vuoto e rimuovere la membrana filtro contenente endospore con pinza sterile e posizionarlo in una piastra di Petri sterile.
    Nota: Il campione di endospore separati è ora pronto per l'analisi a valle. Conservare a -20 ° C se utilizzato per l'estrazione del DNA oppure a 4 ° C se utilizzato per la germinazione e la coltivazione.

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Risultati

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I risultati presentati qui sono stati pubblicati in precedenza 10,21. Si prega di fare riferimento a tali articoli per l'interpretazione ambientale e discussione dei dati.

La procedura generale è riassunto in Figura 1 e corrisponde a tre fasi principali: in primo luogo, la separazione della biomassa da sedimenti o qualsiasi altra matrice ambientale; secondo, la distruzione di cellule vegetative; e terzo, l'analisi a valle delle endospore separati....

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Discussione

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La resistenza di endospore a fattori fisico-chimici aggressivi esterni (ad esempio, temperatura o detergenti) è stato usato per elaborare un metodo per separare endospore batteriche da cellule vegetative in campioni ambientali. Questo è il primo metodo completo per isolare endospore da campioni ambientali in modo non distruttivo. I metodi precedenti per quantificare, rilevare o analizzare endospore in campioni erano basati sulla misurazione delle deleghe specifiche per endospore come l'acido dipicolinico o ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono la National Science Foundation svizzero per Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 e n 151.948, e Fondazione Pierre Mercier pour la Science.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtri a membrana in nitrocellulosa Whatman, 0,2 μ m dimensione dei pori, diametro 47 mmSigma-AldrichWHA7182004 Aldrich 
Tris(idrossimetil)amminometanoSigma-Aldrich252859 Sigma-AldrichCAS 77-86-1
EDTASigma-AldrichE9884 Sigma-AldrichCAS  60-00-4 
Lisozima da albume d'uovo di gallinaSigma-Aldrich62971 Flukain polvere, CAS  12650-88-3 
Omogeneizzatore Ultra-Turrax T18 basicIKA3720000
Portafiltri in vetro per 47  membrane mm, vetro PyrexEMD MilliporeXX10 047 00
Pompa per vuoto per impieghi chimiciMilliporeWP6122050220 V/50 Hz
Collettore di campionamento filtrazione per 25  mm membraneMillipore1225 Collettore di campionamentopolipropilene
DnaseNew England BiolabsM0303SSenza RNAsi
NaOHSigma-AldrichS5881 Sigma-AldrichCAS  1310-73-2 
Sodio dodecil solfato (SDS)Sigma-AldrichL3771 Sigma 
Filtri a membrana in nitrocellulosa Whatman, 0,2 μ m dimensione dei pori, diametro 25 mmSigma-AldrichWHA7182002 Aldrich

Riferimenti

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