È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

26.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53541

⸱

31 dicembre 2015

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Section of Gynecologic Oncology, University of Chicago

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale, composto da cellule mesoteliali umane primarie e fibroblasti stratificati con matrice extracellulare, come strumento per studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Abstract

Il modello di metastasi del cancro ovarico è notevolmente diverso da quello della maggior parte degli altri tumori epiteliali, perché raramente si diffonde ematogenamente. Invece, le cellule tumorali ovariche esfoliate dal tumore primario sono trasportate dal liquido peritoneale ai siti metastatici all'interno della cavità peritoneale. Questi siti, in particolare il peritoneo addominale e l'omento, sono organi ricoperti da una superficie rivestita di mesotelio. Per studiare i processi di disseminazione del cancro ovarico, abbiamo assemblato un complesso sistema di coltura tridimensionale che ricostruisce il rivestimento della cavità peritoneale in vitro. I fibroblasti umani primari e le cellule mesoteliali sono stati isolati dall'omento umano. I fibroblasti sono stati quindi mescolati con la matrice extracellulare e ricoperti con uno strato di cellule mesoteliali umane primarie per imitare le superfici peritoneali e omentali incontrate dalle cellule tumorali ovariche metastatizzanti. Il modello organotipico risultante è, come mostrato, utilizzato per esaminare le prime fasi della disseminazione del cancro ovarico, tra cui l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali. Questo modello è stato utilizzato in numerosi studi per studiare il ruolo del microambiente (cellulare e acellulare) nella disseminazione precoce del cancro ovarico. È stato anche adattato con successo allo screening ad alto rendimento e utilizzato per identificare e testare gli inibitori delle metastasi del cancro ovarico.

Introduzione

Il cancro ovarico è la neoplasia ginecologica più mortale1. La maggior parte dei pazienti viene diagnosticata dopo che il cancro si è diffuso in tutta la cavità peritoneale. Una volta che il cancro si è diffuso in tutta la cavità peritoneale, la chirurgia citoriduttiva e la chemioterapia spesso non sono un trattamento sufficiente per prevenire la recidiva del cancro e la chemioresistenza, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 30%. Le metastasi del cancro ovarico sono prevalentemente limitate alla cavità peritoneale e molti altri tipi di cancro, tra cui i tumori gastrici, pancreatici e del colon, metastatizzano negli stessi siti anatomici nella cavità peritoneale. In generale, le cellule del cancro ovarico si staccano dal carcinoma in situ nelle tube di Falloppio o nel tumore ovarico primario, viaggiano nel liquido peritoneale come cellule singole o sferoidi e si attaccano alle superfici rivestite di mesotelio dell'omento, dell'intestino e della parete addominale2.

Il microambiente tumorale svolge un ruolo importante nella progressione della malattia e nella chemioresistenza in molti tumori3-6. La cavità peritoneale è un microambiente unico, con un monostrato di cellule mesoteliali che copre la maggior parte delle superfici (Figura 1A)7. Il rivestimento mesoteliale funge da barriera che crea una superficie a basso attrito, che tende ad essere protettiva contro l'adesione delle cellule tumorali8. Immediatamente sotto questa superficie rivestita di mesoteliale c'è uno strato costituito prevalentemente da fibroblasti e matrice extracellulare (ECM), che promuovono l'adesione e l'invasione delle cellule tumorali8. Le cellule tumorali ovariche secernono fattori che inducono cambiamenti nel rivestimento delle cellule mesoteliali che migliorano l'adesione, l'invasione e le metastasi delle cellule tumorali ovariche9,10. Le cellule tumorali ovariche aderiscono alla superficie mesoteliale tramite integrina e meccanismi mediati da CD44 (Figura 1B)11-16.

Storicamente, sono stati sviluppati diversi modelli 3D per studiare le interazioni del cancro ovarico con il microambiente. Alcuni dei primi modelli hanno studiato l'interfaccia cancro ovarico-ECM17-21, la comunicazione cancro ovarico-cellule mesoteliali13,14,21-24, o entrambi25 (rivisti da noi 26). Niedbala et al. ha scoperto che le cellule tumorali ovariche mostrano un'adesione più rapida e salda alla ECM rispetto alle cellule mesoteliali o alla sola plastica25. Tuttavia, questi modelli non assomigliavano istologicamente al microambiente peritoneale. Pertanto, abbiamo stabilito un modello organotipico 3D per replicare più accuratamente il microambiente del cancro ovarico. Al fine di comprendere meglio il ruolo del microambiente e l'interazione tra cancro e cellule peritoneali nella disseminazione peritoneale del carcinoma ovarico, abbiamo sviluppato un modello di coltura in vitro organotipico 3D del rivestimento della cavità peritoneale (schema in Figura 1C). Il modello proposto è composto da fibroblasti umani primari e ECM, ricoperti da uno strato di cellule mesoteliali umane primarie: ogni tipo di cellula è isolato dall'omento umano. Istologicamente, questo modello assomiglia al normale rivestimento peritoneale o omentale e fornisce una superficie su cui possiamo studiare il microambiente tumorale, l'interazione tra cellule tumorali e tessuto normale e i processi di adesione, invasione e proliferazione delle cellule tumorali8.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutti i protocolli di ricerca descritti sono stati esaminati dalla University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente prima dell'intervento chirurgico e lo studio è stato approvato dalla University of Chicago IRB. Un tipo cappa di sicurezza biologica 2 e guanti devono essere utilizzate per la manipolazione dei tessuti umani per la protezione e per ridurre il rischio di contaminazione delle cellule.

1. Isolamento e la coltura di cellule stromali primarie non trasformati

  1. Collezione tessuti umani e di preparazione.
    1. Ottenere esemplari di omento umana, 2 cm 3, rimossi durante un intervento chirurgico addominale, e immergere subito tessuto RT tampone fosfato salino (PBS) (Figura 2A). Un pezzo di omento 3 cm x 2 cm produce tipicamente 1 milione di cellule primarie umane mesoteliali (HPMC) e 200.000 fibroblasti umani primari o fibroblasti omentali normali (NOF).
    2. Centrifugare il PBS il tessuto è stato immerso in a 0,5 xg per 3min più presto possibile dopo la raccolta (<2 ore in PBS) e trasferire il tessuto fresco 20 ml PBS in una provetta conica da 50 ml. Tagliare il tessuto in 5mm 3 pezzi da tritare con bisturi in un diametro di 15 centimetri, piatto di coltura sterile (Figura 2B).
  2. Primaria mesothelial umano isolamento delle cellule 8
    1. Per isolare HPMC, trasferire il tessuto tritato in 50 ml provette coniche e attendere 1 minuto per i pezzi solidi di galleggiare verso l'alto (Figura 2C & S). HPMC e globuli rossi (RBC) saranno presenti nel liquido sul fondo. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido dal fondo della provetta e in un nuovo tubo conico. Spin il liquido verso il basso a 0,5 xg per 3 min e aspirare il surnatante dal pellet HPMC / RBC.
      1. Ripetere il processo per tre volte: aggiungere 20 ml di PBS al tessuto tritato, permettono il tessuto a salire, rimuovere il liquido dal basso con una pipetta e nella provetta HPMC / RBC, spin down, e rimuovere ilsurnatante. Dopo che tutti i giri sono stati completati e il surnatante viene aspirato, il pellet conterrà HPMC e RBC.
    2. Piatto tutte le cellule del pellet in un pallone 75 cm 2 in 15 ml di terreni di crescita completo (DMEM con 10% di siero fetale bovino [FBS], 1% vitamine MEM [93 mg / L], 1% di acidi MEM amminoacidi non essenziali [81.4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]).
    3. Eseguire un lavaggio secondario PBS per isolare HPMCs supplementari.
      1. Per la PBS secondario lavare, scuotere il tessuto solido residuo a 200 rpm, 37 ° C per 10 minuti in 20 ml di PBS, quindi attendere 1 minuto per il tessuto di galleggiare verso l'alto. Rimuovere il liquido dal fondo della provetta in un nuovo tubo, centrifugare a 0,5 xg per 3 min, e aspirare il surnatante.
      2. Piatto tutto il HPMC / RBC dal PBS secondario lavare in un pallone di 75 cm separata 2 in 15 ml di terreni di crescita completa.
    4. Per isolare ogni rNumero residua HPMC, agitare il tessuto macinata a 200 rpm, 37 ° C ° per 10 min a 20 ml di una miscela 1: 1 0,25% tripsina mM EDTA 25: soluzione PBS in volume. Lasciare il tessuto a salire, raccogliere il liquido sul fondo della provetta in un nuovo tubo 50 ml, e spin giù a 0.5 gx 3 min.
      1. Aspirare il surnatante e piastra tutto il HPMC / RBC in un pallone di 75 cm 2 separata in 15 ml di terreni di crescita completa.
    5. Cultura le cellule piastrate a 37 ° C e 5% CO 2 in un ambiente umidificato. Mangimi cellule placcato con l'aggiunta di 15 ml di media piena crescita nei giorni 3 e 5 senza rimuovere i media spesi. HPMC può essere coltivato per 5-7 giorni prima della scissione.
      1. Utilizzare a basso passaggio HPMC (fino a passaggio 2) in tutti gli esperimenti per ridurre al minimo dedifferenziazione e la modifica di fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a grande campo, preferibilmente con un obiettivo 20x con funzionalità di contrasto interferenza differenziali plastica o obiettivo 4-20x con capabilitie contrasto di fases (filtri di contrasto di fase sul microscopio) per l'adozione di tutte le immagini delle cellule, e un obiettivo 10x () in campo chiaro per analizzare immunoistochimica 3,3'-diaminobenzidina (DAB) colorazione.
    6. Verificare che il HPMC sono cubica ed esprimere citocheratina 8 e vimentina eseguendo immunoistochimica 8 (figura 3A, C, E).
  3. NOF isolamento 8
    1. Preparare 10 ml di uno stock di soluzione di tipo collagenasi III (10x) mediante la combinazione di un 1: 1: 1 miscela di 100x Pen-Strep: 1.500 unità di attività / ml di collagenasi di tipo III: attività 714 unità / ml di ialuronidasi in PBS.
    2. Agitare il tessuto omento macinata, che rimane dopo l'isolamento HPMC a 200 rpm, 37 ° C per 6 ore in 10 ml di soluzione di 10x collagenasi tipo III diluito nei media senza siero (DMEM con 1% vitamine MEM [93 mg / L], 1% MEM aminoacidi non essenziali [81,4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]). Tessuto digerito sarà opaco e potrebbe avere alcuni detriti fibroso (Figura 2E).
    3. Centrifugare le cellule NOF soluzione contenente in sospensione a 0,5 xg per 3 min a RT, aspirare il supernatante e piastra il pellet in un pallone 75 cm 2 in 13 ml di terreni di crescita completa.
    4. Rimuovere vecchi media e sostituirlo con 15 ml di fresco terreni di crescita completo dopo 24 ore. NOF può essere coltivato per 1-3 giorni prima della scissione. Nota proliferazione del NOF cesserà quando le cellule raggiungono confluenza.
    5. Confermare che i fibroblasti umani primari sono, cellule allungate piatte ed esprimono vimentina, ma non citocheratina 8 eseguendo immunoistochimica 8 (figura 3B, D, F). Utilizzare a basso passaggio NOF per esperimenti (idealmente prima del passaggio 3) per ridurre al minimo dedifferentiation e modifica di fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a grande campo con un obiettivo 20x con funzionalità di plastica DIC dell'adozione di tutte le immagini in fase di cellule,e un obiettivo 10x in campo chiaro per analizzare immunoistochimica DAB colorazione.

2. Placcatura Cultura organotipica 8

  1. NOF uscita dal pallone di coltura 75 cm da risciacquo con 10 ml di PBS seguita da 3 ml di 0,25% / 25 mM EDTA tripsina per non più di 5 min. Neutralizzare tripsina con almeno 3 volte il volume del terreno di coltura completo.
  2. Trasferire le cellule trypsinized in una provetta da 50 ml e spin down a 0.5 gx 3 min. Rimuovere il surnatante e portare le cellule back up in 5 ml di media piena crescita. Utilizzare un contatore di cellule per contare le cellule recuperate dal pallone di coltura.
  3. Diluire le cellule nel volume appropriato di supporto piena crescita al piatto 2.000-4.000 NOF per 100 microlitri su un piatto nero, chiaro a fondo, 96 pozzetti. Aggiungere 0,5 mg / 100 ml di coda di topo collagene I alla miscela cella prima placcatura. Let cellule siedono a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per almeno 4 ore, o fino a quando le cellulead aderire alla superficie della piastra.
  4. Rilasciare HPMC dal pallone di coltura usando gli stessi metodi descritti in fasi 2.1 e 2.2. Diluire le cellule nella quantità appropriata di terreni di crescita completo alla tavola 10.000-20.000 HPMC per 50 microlitri in cima al NOF già placcato con collagene I in piastre da 96 pozzetti. Lasciare le cellule siedono a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per almeno 18 ore prima di iniziare esperimenti.
  5. La proteina fluorescente verde Cultura (GFP) esprimente le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 nei media piena crescita. Le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 sono fluorescente da espressione di un vettore lentivirale che esprime copepodi cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 dovrebbe essere 80-90% confluenti il ​​giorno di utilizzo (fase di crescita logaritmica). Rilasciate le cellule dalla piastra di coltura e contare con le stesse modalità descritte nei passaggi 2.1-2.2 per le cellule primarie.
  6. Consentire cellule di cancro ovarico di recuperare nei media piena crescita per 15-20 minuti a 37 ° C in untubo conico con coperchio sigillato liberamente.

3. Adesione saggio 8

  1. Dopo il recupero, agglomerare le cellule di cancro ovarico, facendo girare per 3 min a 0,5 xg e poi rimuovere il surnatante e diluire le cellule nel volume adeguato di mezzi privi di siero per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule / 100 microlitri.
  2. Capovolgere le piastre a 96 pozzetti con / NOF colture organotipiche HPMC per rimuovere il supporto spesi, e aggiungere 100 ml di sospensione cellulare di cancro nei media senza siero in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 30 minuti a 4 ore.
  3. Capovolgere la piastra a 96 pozzetti per rimuovere i media e le cellule non aderenti. Utilizzare una pipetta multicanale a bassa potenza da Dispensare attenzione e delicatezza 100 ml di soluzione in ciascuno bene, e invertire di nuovo piatto. Ripetere la PBS lavare una volta di più.
  4. Inverti per rimuovere PBS e aggiungere 100 microlitri paraformaldeide 4% in ogni pozzetto. Lasciare la piastra a sedere per 20 min per fissare le cellule. Dopo 20 minuti, capovolgere la piastra e aggiungere 100 microlitri di PBS.
  5. Si noti che la fluorescenza totale di pozzetti possono essere segnalati o il numero di cellule può essere quantificata. Per la quantificazione, prima piastra una curva standard in duplicato utilizzando cellule HeyA8 ad una concentrazione di 1 milione di cellule / ml.
    1. Rendere la curva standard riducendo la velocità 1 milione di cellule, rimuovendo i media, e consentendo loro di sedersi in 1 ml di paraformaldeide 4% per 20 min.
    2. Spin cellule di nuovo e portare fino in 1 ml di PBS (cellule raccontano per confermare 1.000.000 / concentrazione ml). Piatto 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000, e 0 cellule in ciascun pozzetto in duplicato, e aggiungere PBS per un volume totale finale di 50 microlitri in ciascun pozzetto.
  6. Fondo leggere la piastra di coltura su un lettore di fluorescenza piatto (eccitazione = 488 nm, emissione = 528 nm), il ridimensionamento alti pozzi (50.000 in curva standard). Utilizzare la curva standard per calcolare il numero di cellule di cancro ovarico aderito alla organotypcultura ic in ciascun pozzetto (Figura 4A-C).

4. Proliferazione Assay 10

  1. Dopo che le cellule tumorali dell'ovaio recuperare (vedere i passi 2.5 e sopra 2.6), agglomerare le cellule facendo girare per 3 min a 0,5 xg e quindi diluire le cellule nel volume appropriato di 1% FBS supporti (DMEM con 1% FBS, 1% MEM vitamine [93 mg / L], 1% MEM aminoacidi essenziali [81,4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]) per ottenere una concentrazione di 4.000 cellule / 150 ml.
  2. Capovolgere la piastra a 96 pozzetti con i HPMC / NOF colture organotipiche di estrarre il supporto spesi, e aggiungere 150 ml di sospensione cellulare cancro nel 1% dei media FBS in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 72 hr.
  3. Fondo leggere la piastra di coltura su un lettore di piastre a fluorescenza una volta al giorno (di eccitazione = 488 nm, emissione = 528 nm) per valutare la relativa proliferazionedi cellule. Continuare il test per 96 ore, cambiando i media a 48 ore (Figura 5A-C). Fare attenzione a non disturbare la cultura quando si cambia supporto (invertendo il piatto è preferibile).

5. Invasione Assay 8

  1. Prima di placcatura la cultura 3D, aggiungere 7,5 mg coda di topo collagene I in 200 l di PBS a 24 pozzetti inserto piastra di coltura (8 micron dimensione dei pori). Lasciate che la piastra di incubare O / N, quindi rimuovere con cautela la PBS con una pipetta immediatamente prima placcatura cultura organotipica HPMC / NOF sugli inserti collagene rivestite (step 2, sopra).
  2. Preparare le cellule tumorali ovariche come al punto 3.1. Al piatto le cellule tumorali ovariche sulle colture organotipiche sugli inserti, utilizzare con cautela una pipetta per rimuovere l'eccesso supporto dalla parte superiore degli inserti. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare tumore ovarico in mezzi privi di siero in ciascun pozzetto.
  3. Aggiungere 750 ml di media piena crescita nel pozzo sotto l'inserto di indurre cellule del cancro invasion nelle culture organotipiche. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 24 ore.
    Nota: le cellule tumorali ovariche che invadono la cultura organotipica attraverserà l'inserto e rimanere sul lato inferiore dell'inserto.
  4. Dopo 24 ore, cogliere l'inserto con le pinze e brevemente sciacquarlo in un bicchiere di PBS, quindi spostare l'inserto in un pozzo vuoto. Scrub parte superiore di ogni inserto con entrambi i lati di un batuffolo di cotone per un totale di 1 min. Introdurre rapidamente l'inserto in un piatto contenente 750 ml 4% paraformaldeide in ogni pozzetto. Consentire ad ogni inserto di sedersi in paraformaldeide per 10 minuti prima di trasferire gli inserti nei pozzetti riempiti con 750 l di PBS.
  5. Vedi le cellule invase (aderito e fissati al fondo di inserti) con un microscopio a 2,5x. Quando l'intero pozzo è all'interno del campo di vista, regolare l'ingrandimento di 10x e prendere 5 immagini, uno vicino al centro e 1 in ciascun quadrante del pozzo, evitandoprendendo immagini troppo vicino ai bordi. Seguire lo stesso schema per ogni bene.
  6. Utilizzare il programma del produttore per contare il numero di cellule in ogni immagine per ottenere un numero medio di cellule invase per campo in ogni pozzetto (Figura 6A-C) in base al loro protocollo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La coltura organotipica stato assemblato mescolando dapprima fibroblasti umani primari con collagene di tipo I e quindi sovrapponendo questa cultura con 5 volte il numero di cellule mesoteliali. La cultura è stata incubata per almeno 18 ore prima di cellule di cancro ovarico sono stati aggiunti per studiare l'adesione, invasione o la proliferazione. Ciascun test è stato ripetuto con multiplo (n = 3-5) culture 3D ottenuti da pazienti diversi e numerosi pozzi sono stati testati in ciascuna condizione per l'adesion...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Un modello organotipica del microambiente peritoneale è stato istituito per valutare la funzione individuale e collettiva (s) di entrambi i componenti cellulari e innate del microambiente in ovarico diffusione del cancro. Sono disponibili i protocolli specifici per la placcatura e personalizzare la cultura organotipica 3D per indagare ovarico adesione delle cellule tumorali, la proliferazione e l'invasione. Cellule primarie umane omentali mesothelial e fibroblasti sono stati isolati da pazienti e utilizzati in un pa...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo tutti gli specializzandi e i medici curanti, in particolare il Dr. A.F. Haney (Università di Chicago, Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia) per aver raccolto biopsie omentali. Inoltre, ringraziamo Stacey Tobin e Gail Isenberg per aver curato attentamente questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da Bears Care, il beneficiario di beneficenza del Chicago Bears Football Club, del National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702 e del National Cancer Institute che concede R01 CA111882 a E.L.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1. Isolamento e coltura di cellule primarie
PBSFisher ScientificSH3001304
Lamette da barba a taglio singoloFisher Scientific12-640
Piastre di coltura da 15 cmBD Biosciences353025
Pallone di vetro??
Siero fetale bovino (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM con L-glutamminaCorning10-013-CV
MEM VitamineCorning25-020-Cl
MEM Aminoacidi non essenzialiCorning25-025-CI
Penicillina-StreptomicinaCorning30-002-CI
Agitatore Thermo-FisherMaxQ 4450
CentrifugaEppendorf5702
IncubatoreThermo-FisherForma Serie II Modello 3100
Tripsina EDTA, 1x (0,25%)Corning25-053-CI
HyaluronidasiWorthington BiochemicalLS002592
T-75 PalloniBD Biosciences
Fiasche 353136 T-175BD Biosciences353112
Punte per pipetteRaininP2, P10, P20, P200 e P1000
Punte per pipetteCorningPunte filtrate P2, P10, P20, P200 e P1000
strong>Nome del reagenteAziendaNumero di catalogoComments/Description
2. Placcatura Contatore di cellule 3D
Cell CounterInvitrogenCountess
Countess Cell Counting Camera VetriniInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061
Collagene di tipo I (coda di ratto)BD Biosciences354236
Piastra a 96 pozzetti, fondo trasparente, BD nero Biosciences353219
Nome del reagente/ AttrezzaturaAziendaNumero di catalogoComments/Description
3. Saggio di adesione
Pipetta multicanaleEppendorfXplorer 300
Soluzione di paraformaldeide 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Lettore di piastreDispositivi molecolariMinimax
Nome del reagente/ AttrezzaturaAziendaNumero di catalogoComments/Description
5. Test di invasione
Inserti per colture cellulari (8um, 24 pozzetti)BD Biosciences353097
Tamponi di cotoneQ-tipsMicroscopio
ZeissAxiovert 200m
Cell Profilerdi pubblico dominio
Piastra a 24 pozzettiBD Biosciences353047
Nome del reagente/ AttrezzaturaAziendaNumero di catalogoComments/Description
6. Anticorpi
Anti-Integrina & alfa; Vβ 3 Anticorpi, clone LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058
a CO2 rivestito ad acqua <

Riferimenti

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Modello della cavità peritonealecellule mesoteliali umane primariefibroblasti dell'omento normaleadesione delle cellule tumoraliinvasione delle cellule tumoraliproliferazione delle cellule tumoraliinibizione tramite peptide RGDanticorpi bloccanti delle integrine
Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.