È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

I metodi per scoprire alternative Uso Promotore e regolazione trascrizionale di Murine Bcrp1

7.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53827

⸱

27 maggio 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 2Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, 3Baltimore VA Medical Center, 4Membrane Transport and Biopharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences, Kanazawa University, 5Obstetrics, Gynecology and Reproductive Science, University of Pittsburgh, 6Magee Women's Research Institute, 7Obstetrics, Gynecology, Perinatal Research Branch (NICHD), Wayne State University School of Medicine, 8Medicine, University of Maryland School of Medicine, 9Pathology, University of Maryland School of Medicine, 10Pharmacology, University of Maryland School of Medicine, 11Experimental Therapeutics, University of Maryland School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Con il murino ABC trasportatore Bcrp1 (ABCG2), come esempio, in-silico protocolli sono presentati per rilevare utilizzo promotore alternativo geni espressi in tessuti di topo, e per valutare la funzionalità dei promotori alternativi identificati mediante saggi del reporter.

Abstract

L'espressione genica in diversi tessuti è spesso controllata da promotori alternativi che risultano nella sintesi di mRNA con uniche - di solito non tradotte - primi esoni. Bcrp1 (ABCG2), il ortologo murino della ABC trasportatore Breast Cancer Resistenza Protein (BCRP, ABCG2), ha almeno quattro promotori alternativi che sono designati dai corrispondenti quattro primi esoni alternativi prodotte: E1U, E1A, E1B, e E1C. Qui, in-silico protocolli vengono presentati per prevedere l'utilizzo promotore alternativa per Bcrp1. Inoltre, metodi di analisi giornalista sono descritti per produrre costrutti reporter per promotori alternativi e per determinare la funzionalità dei promotori putativi monte dei primi esoni alternativi identificati.

Introduzione

Più della metà dei geni umani sono regolati dai promotori alternativi 1. Ogni promotore alternativa può contenere elementi regolatori che possono essere diverse da quelle degli altri promotori alternativi. Il promotore (s) utilizzato in un tessuto può differire da quelli utilizzati in un altro tessuto. Ad esempio, è possibile che l'attivazione di un dato percorso di segnalazione può attivare il promotore alternativa a un gene utilizzata in un tessuto, ma non hanno alcun effetto o reprimere un promotore alternativa separato per lo stesso gene che viene utilizzata in un altro tessuto.

L'espressione del gene Bcrp1 è governato da promotori alternativi. Bcrp1 è il ortologo murino del gene materno Resistenza Cancer Protein (BCRP). BCRP è un trasportatore di ATP-binding cassette (ABC), ABCG2 2, 3 formalmente designato. Come una proteina di membrana apicale, BCRP funzioni / Bcrp1 di efflusso una vasta gamma di substrati naturali e xenobiotici 3, 4. Negli esseri umani e topi, BCRP / Bcrp1 è altamente espresso negli organi farmacologicamente rilevanti come fegato (canalicoli biliari), intestino e reni, nonché organi con barriere sangue-tessuto come placenta, cervello e testicoli 2, 5 - 12. L'espressione di BCRP / Bcrp1 in ematopoietiche e di altre cellule staminali, comprese le cellule staminali del cancro, può conferire resistenza di queste cellule di xenobiotici e cancro farmaci chemioterapici 3.

Nel lavoro presto per capire la regolazione dell'espressione BCRP in cellule normali e neoplastiche, 5 'rapida amplificazione del cDNA estremità (5'-RACE) analisi di BCRP mRNA è stata eseguita per determinare il suo sito di inizio della trascrizione esatta 13. Non solo erano più siti di inizio della trascrizione trovati; anche incontrato erano tre forme alternative di primo esone, che a sua BCRP è tradotto. Queste alternative primi esoni - designati E1a, E1b, E1c - sono stati espressi in modo diverso in una varietà di tessuti umani. Due ulteriori varianti primo esone sono stati scoperti in una ricerca BLAST del database EST umana utilizzando il secondo esone del BCRP 13. Quattro partite rivelato un primo esone> 70 kb a monte dell'esone 2 che sono stati designati E1U; altre quattro partite hanno rivelato BCRP mRNA che mancava di un primo esone del tutto, che sono stati designati E1 13. La presenza di esoni capo alternativi è considerato una manifestazione di utilizzo promotore alternativa 14.

Nei topi, quattro alternative primi esoni di Bcrp1 sono descritte che può corrispondere ai promotori alternativi che governano BCRP 1 trascrizione in diversi tessuti di topo; questi esoni / promotori sono designati E1U, E1A, E1B e E1C, e si trovano a circa 70, 58, 15, e 5 kb a monte Bcrp1 esone 2 5, 15. L'isoforma E1A mRNA è risultata predominante in MurinLe cellule staminali ematopoietiche e, cuore, polmone, milza e cervello, mentre l'isoforma E1B è stata espressa in nell'intestino del mouse, le cellule del fegato fetale, e precursori eritroidi nel midollo osseo 5, 15. Il promotore a monte E1B ha dimostrato di essere il principale promotore di alternativa di governo Bcrp1 trascrizione nell'intestino del mouse, regolato almeno in parte, da fosfo-ciclico-AMP risposta elemento binding protein (p-CREB) e un elemento di risposta CREB unico per quella alternativa promotore Bcrp1 16. L'isoforma E1C mRNA è prevalentemente espresso nel fegato murino adulti e reni 5. L'isoforma E1U è rilevabile nella maggior parte dei tessuti esaminati eccetto testicolo murino, dove è l'isoforma predominante espresso 5. Bcrp1 espresso in testicoli di ratto si trova in entrambe le somatiche (giunzioni strette endoteliali, cellule myoid peritubulari, e cellule di Sertoli) e le cellule germinali (nel endotelio seminifero, dove si può proteggere spermatidi fase tardo-4). il region monte E1U contiene un elemento di risposta funzionale per steroidea factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA e di proteine ​​sono marcatamente ridotti nei testicoli di topi knockout Sertoli cellule specifiche SF-1, suggerendo che l'espressione Bcrp1 in cellule di Sertoli murine è controllato da SF-1 5.

I protocolli presentati metodi dettaglio per rilevare alternative primi esoni del Bcrp1 in-silico, e di stabilire saggi luciferasi-based per i promotori putativi monte dalle prime esoni alternativi individuati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. previsione in silico della alternativi primi esoni del Bcrp1 Usando BLAST Analisi del mouse EST database

Nota: Questo protocollo viene descritto come cercare il tag del mouse sequenza espressa (EST) del database per EST con similarità di sequenza di esone 2 di Bcrp1 (che contiene il sito di inizio traslazionale) e poi come allineare le corrispondenti sequenze EST di sequenze genomiche per accertare il loro posizione nel topo Bcrp1 gene rispetto alla estremità 5 'di Bcrp1 dell'esone 2.

  1. Ottenere la sequenza per il mouse Bcrp1 esone 2 inserendo l'ID sequenza di riferimento di mRNA (NM_011920.3) nella finestra di ricerca del Ensembl Genome Browser 17, cliccare su "GO". Nella schermata successiva, selezionare una sequenza full-length (contiene 16 esoni):
    1. Nella schermata successiva ( "Trascrizione a base Display"), selezionare "16 esoni." Verrà visualizzata una schermata che contiene la sequenza di tutti gli esoni di Bcrp1. Exon 2 di Bcrp1 leggerà "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "I risultati ottenuti saranno simili a quelli mostrati in riferimento 18..
    2. Fare clic sull'opzione "Download sequenza". Nella schermata successiva, scegliere il formato FASTA, e quindi fare clic su "Anteprima". Nella schermata successiva, copiare la sequenza Anteprima dell'esone 2 negli appunti.
  2. Passare alla home page BLAST 19 sul National Center for Biotechnology Information (NCBI) sito web 20.
    1. Selezionare genoma "Mouse". Incollare la sequenza dell'esone 2 dagli appunti nella casella di ricerca.
    2. Seleziona "EST" dal menu a discesa del database, ottimizzare per "sequenze altamente simili," e quindi scegliere "BLAST". Durata richiederà alcuni minuti. Quando la corsa BLAST è completo, verrà visualizzata la pagina "Risultati".
    3. Sotto la voce "Descrizione" della pagina "Risultati", selezionare "ALL", quindi "Download", quindi "FASTA (completosequenza) "nel menu a discesa, e poi scegliere" Continua "Apparirà un file txt,. aprire e copiare l'intero file negli appunti Il file txt contiene le sequenze di tutte le EST ad alta sequenza somiglianza con il exon2 del mouse Bcrp1. ma non la loro posizione rispetto al esone 2 del gene Bcrp1.
      Nota: L'analisi eseguita su 15 aprile 2015 ha individuato 14 EST murini che allineata con Bcrp1 esone 2. Questi sono elencati nella tabella 1.
  3. Identificare la posizione della sequenza EST che è 5 'to esone 2 del gene Bcrp1. Il gene del mouse Bcrp1 si trova nel cromosoma 6 contig NC_000072.6 (GI: 372.099.104).
    1. Sulla homepage BLAST sotto il sottotitolo "Blast Specialized", selezionare "Allinea due (o più) sequenze utilizzando BLAST (bl2seq)."
    2. Incollare il file di testo dagli appunti nella casella di ricerca e digitare 372099104 nella casella sequenza di soggetto. Ottimizza per "sequenze altamente simili" nell'ambito del programmaselezione e BLAST eseguire.
    3. Una volta visualizzata la finestra dei risultati, visualizzare gli allineamenti graficamente cliccando su "Grafica" nella finestra "allineamenti". Utilizzare le frecce destra e sinistra e zoom per concentrarsi su Bcrp1 / ABCG2 e gli allineamenti di sequenze.
    4. Salvare gli allineamenti di sequenza: selezionare "ALL" nella casella "Descrizione", poi sotto il "download" a discesa selezionare "Hit tabella (CSV)," e quindi fare clic su "continua". Questo file contiene l'allineamento di sequenze di Bcrp1 esone 2 e l'allineamento di tutte le sequenze EST con similarità di sequenza a Bcrp1 exon2 relative alla numerazione dei nucleotidi nel topo cromosoma 6 contig. Ogni sequenza completa EST potrebbe generare più allineamenti che abbracciano le regioni 5 'e 3' to esone 2 comprese le sequenze che si sovrappongono con Bcrp1 esone 2.
    5. Poiché la posizione di estremità 5 'dell'esone 2 corrisponderà al nucleotide 58.655.638 nel cromosoma 6 contig, designare questo come+1, Quindi calcolare la posizione delle sequenze parziali di ciascun EST 5 'a 58.655.638. I risultati per le 14 EST sono riportati nella tabella 1.
      Nota: Fare attenzione ad analizzare le sequenze EST che sono 5 'a +1 (ad esempio, avere un valore negativo nucleotide) come potenziali primi esoni. Ad esempio, in due delle EST che allineati con Bcrp1 esone 2 mostrato nella Tabella 1 (AI647825 e AI664571) la sequenza rimanente era 3 'to esone 2.

Funzione 2. Valutazione di Bcrp1 Alternative Promotore

  1. Progettazione di giornalista costrutti per Bcrp1 E1U, E1A, E1B e promotori E1C
    1. Utilizzando la sequenza di E1U ottenuto dalla ricerca nel database EST, designare i primi 5 'nucleotide di E1U come +1.
    2. Ottenere un cromosoma artificiale batterico (BAC) clone di topo cromosoma 6 che contiene la sequenza genica Bcrp1 / ABCG2 e la sequenza di almeno 100 kb a monte dellaBcrp1 / ABCG2 gene (vedi elenco dei materiali e attrezzature).
      1. Identificare un adatto vettore giornalista come la luciferasi giornalista plasmide pGL3-base.
      2. Determinare i polylinker nel vettore giornalista. KpnI, Saci Mlu1, NheI, Smal, XhoI, BglII e HindIII sono i siti di restrizione endonucleasi nel sito di clonazione multiplo del vettore pGL3-base, nel 5 'a 3' orientamento.
        Nota: La sequenza dei siti di digestione è disponibile da cataloghi di prodotti di aziende che producono gli enzimi di restrizione.
      3. Identificare tutti i siti di digestione della esone E1U e la regione 2 kb 5 'di E1U utilizzando programmi software come DNA5. Individuare almeno due siti di digestione nel polylinker pGL3-base che non si trovano in E1U o la regione a monte 2 kb.
        Nota: assicurarsi di scegliere un sito di restrizione polylinker per il primer in avanti che sta a monte di quello scelto per il primer inverso per assicurare che il wil insertol è nella corretta posizione.
    3. Preparare in avanti e primer per PCR che contengono sequenze per i siti multipli di restrizione sito di clonazione endonucleasi PGL3-base selezionati che utilizzano i servizi di sintesi del gene / primer commerciali o software selezione di primer (vedi elenco dei materiali e attrezzature) retromarcia. Selezionare un primer in avanti trova ~ 2 kb a monte della sequenza di E1U e un primer inverso all'interno della sequenza E1U. I primers utilizzati nei autori lavoro precedente incorporati un sito SacI nel primer forward, e un sito NheI nel primer reverse, e amplificate la regione genomica da circa -1.906 al +64 con il primo 5 'nucleotide di E1U specificato come + 1 (vedi al punto 2.1.1), e sono fornite in riferimento 16.
      1. PCR amplifica la regione genomica E1U l'utilizzo di questi fondi, 0,01-1 mg del BAC, e la PCR master mix contenente Taq polimerasi ad alta fedeltà (vedi elenco di materiali e attrezzature) con denaturazione a95 ° C per 30 sec, quindi 35 a 40 cicli di PCR, con estensione a 72 ° C (2 minuti), e ricottura e temperature di fusione in base alle caratteristiche di fusione dei primer utilizzati.
        Nota: L'uso di alta fedeltà Taq polimerasi è essenziale per le regioni promotrici sequenziamento che hanno un elevato contenuto di GC. Quando si utilizzano grandi frammenti di DNA genomico, come un tasso alcolemico come modello, la struttura secondaria del DNA genomico può rendere difficile per primer PCR per legare. Se questo problema si pone, migliori risultati PCR possono essere ottenuti se il modello DNA genomico lungo viene tagliata delicatamente per sonicazione prima della reazione di PCR.
      2. Rilevare la lunghezza del prodotto di PCR amplificato confrontando contro una scaletta DNA 1 kb usando 0,8% TAE gel di agarosio.
    4. Digerire il prodotto PCR ottenuto e il vettore pGL3-Basic, utilizzando l'endonucleasi di restrizione specifica per i siti di digestione di restrizione introdotte nel primer avanti e indietro secondo instructions forniti con gli enzimi di restrizione digestione.
      1. Purificare le reazioni di digestione mediante gel SV commerciale e kit per la PCR Clean-Up Systems (vedi Lista dei Materiali e attrezzature), seguendo il protocollo kit di 21.
        1. Verifica digestione e linearizzazione del vettore confrontando il vettore uncut usando elettroforesi su gel di agarosio, quindi tagliare e purificare il DNA band vettore digerito. Misurare la concentrazione del prodotto purificato PCR e il vettore purificato mediante spettrometria UV (vedi elenco dei materiali e attrezzature).
    5. Preparare il giornalista costrutto E1U legando il purificato, enzima di restrizione digerito prodotto di PCR e pGL3-Basic lucciola luciferasi giornalista vettore (contenuta nel kit di analisi giornalista, vedere elenco dei materiali e macchinari) a inserto: rapporti di vettore di 11, 21 e 31, utilizzando il "T4 DNA ligasi kit legatura rapida" come da istruzioni del kit 22, producendo in tal modo la E1U reporter costrutto, chiamato pGL3-E1U.
      1. Utilizzare il plasmide pGL3-E1U per trasformare i batteri per espandere clonale pGL3-E1U seguenti istruzioni nel kit di clonazione TA (vedi elenco dei materiali e attrezzature).
      2. Conferma l'orientamento e la fedeltà dell'inserto mediante analisi di sequenza.
    6. Preparare giornalista costrutti per E1A, E1B e E1C utilizzando la metodologia simile a quella per E1U. Confermare la fedeltà degli inserti di sequenziamento come nella sezione 2.1.5.2.
      Nota: Gli inserti promotore per E1A, E1B e E1C dovrebbe essere di circa -1875 / + 10, -1847 / + 60, e -1904 / + 83 rispetto al primo 5 'nucleotide (designato come +1) di E1A, E1B, o E1C rispettivamente.
  2. Metodi di analisi Reporter
    Nota: Strategia generale di saggi Reporter: il promotore putativo (5 'upstream regione) di un gene viene inserito nel sito di clonazione multiplo di un vettore vuoto "reporter" che contiene un "reporter gene "(ad esempio, lucciola luciferasi) a valle del sito di clonaggio multiplo. Il vettore viene poi trasfettato in cellule eucariotiche che esprimono il gene di interesse. I fattori trans-acting che promuovono l'espressione del gene di interesse in queste cellule deve attivare la promotore nel vettore giornalista transfettate, causando espressione di luciferasi di lucciola, che può essere facilmente quantificato con un saggio luminescenza.
    1. Selezionare la linea cellulare appropriata da utilizzare per il saggio giornalista.
      Nota: Per valutare l'attività del promotore E1U alternativa giornalista costrutto, è necessario trasfezione che costruiscono in cellule che esprimono Bcrp1 sotto il controllo del promotore E1U. La linea cellulare murina Sertoli TM4 (vedi elenco dei materiali e macchinari) esprime la proteina Bcrp1 e Bcrp1 mRNA contenente E1U, così come E1A, E1B, e E1C 5. Come controllo negativo, considerare l'utilizzo di una linea cellulare che non esprime la proteina Bcrp1 o mRNA.
    2. Cultura ce TM4lls in piastre da 24 pozzetti ad una densità iniziale di 200.000 cellule / pozzetto in una miscela 1: 1 di mezzo F12 di Ham modificandoli mezzo di Dulbecco Eagle con bicarbonato di sodio 1,2 g / L, 15 mM HEPES integrato con 5% siero di cavallo, 2,5% siero fetale bovino, penicillina (100 UI / ml), e streptomicina (100 ug / ml), a 37 ° C, 5% CO 2, come descritto in precedenza 5.
    3. Sei ore dopo aver piazzato le cellule in coltura, trasfezione le cellule con 0,2 mcg di vettore vuoto pGL3-base o con 0,2 mg di pGL3 vettore contenente il E1U -1906 / + 64 o -1875 / + 10 E1A o -1847 / + 60 E1B o -1904 / + 83 E1C BCRP 1 delezione costruire insieme a 4 ng di prl-TK (un Renilla luciferasi che esprimono vettore) come controllo interno, utilizzando un kit trasfezione del DNA commerciale e il protocollo 23 del produttore (vedi elenco dei materiali e attrezzature) .
    4. 30 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto della crescita della culturEd transfettate cellule. Lavare le cellule una volta con 200 ml di PBS, quindi rimuovere la soluzione di lavaggio.
      1. Misurare lucciola e Renilla attività luciferasi utilizzando un kit commerciale secondo i protocolli 24 del produttore.
    5. Esprimere l'attività per ciascun tubo come il rapporto tra l'attività della luciferasi di lucciola diviso per il (luciferasi Renilla) controllo interno; risultati complessivi sono generalmente espressi come attività di ciascuna giornalista costrutto rispetto a quello delle cellule trasfettate con il vuoto pGL3 vettore di base, che è dato un valore 1.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Identificazione di BCRP 1 alternativa utilizzo promotore nei testicoli del mouse attraverso l'analisi degli esoni capo

Quando il database EST a NCBI era sondato (aprile 2015) utilizzando la procedura descritta nel protocollo 1, le EST scoperto che erano contigui con 5 'dell'esone 2 in BCRP 1 mRNA sono riportati nella tabella 1, in...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

La maggior parte dei metodi e dei risultati rappresentativi presentati sono descritti nel precedente lavoro intitolato "B crp1 trascrizione nei testicoli del mouse è controllato da un promotore a monte di un romanzo primo esone (E1U) regolato da steroidea fattore-1", che è stato pubblicato nel 2013 5 . Oltre ai risultati rappresentativi raffigurati, la carta precedente fornito stime delle alternative prima utilizzazione esone usando 5'-RACE metodologia PCR e RT-PCR. Inoltre, in-sili...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Douglas D. Ross e l'Università del Maryland, Baltimora titolari di diritti di brevetto per BCRP umana.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da Merit Review Awards per Douglas D. Ross e per Arif Hussain dal Department of Veterans Affairs.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MATERIALI E KIT BIOLOGICI COMMERCIALI:
Kit RLM-RACE di prima sceltaAmbion Inc., Austin, TX, attualmente disponibile tramite Life TechnologiesAM1700Kit PCR 5'-RACE
Kit di clonazione TOPO TALife TechnologiesK450001Questo kit contiene i batteri TOP10 chimicamente competenti E. coli.
Kit di legatura rapida T4 DNA ligasiNew England BiolabsM2200
Faststart Taq- DNA polimerasiSigma-Aldrich/Roche3553400001/RMB-4738284001 Contiene una miscela di enzimi polimerasi Taq ad alta fedeltà
Reagente di trasfezione del DNA XtremeGENE HPreporter Roche6366236001
Dual-luciferasePromegaE1910Include il vettore reporter vuoto pGL3-basic (luciferasi di lucciola), il vettore che esprime la luciferasi renilla pRLTK e altri vettori di controllo.
QIAprepQiagen27104Per miniprep plasmidico - isolamento e purificazione del DNA plasmidico da colonie batteriche,
vettore pCR2.1parte del kit
basica pGL3-contenente il vettorePromegaE1751
pRL-TK, Renilla, luciferasi che esprime il vettorePromegaE2241
cromosoma artificiale battericoCentro risorse BACPAC, Bambini s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CARP23-285A12 e RP24-314E24http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzolLife Technologies15596026
Wizard® Sistema di pulizia SV Gel e PCR PromegaA9281Utile per purificare i prodotti PCR dopo la digestione con endonucleasi di restrizione
CRYOVIALS DenvilleScientificV9012
SOFTWARE:
Ensembl softwareProgetto Ensemblhttp://Ensembl.org Il progetto Ensembl produce banche dati genomiche per vertebrati e altre specie eucariotiche e rende queste informazioni disponibili gratuitamente online.
Software di sabbiaturaNCBIhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
Rete & PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 softwareSimgenehttp://simgene.com/Primer3Utile per la progettazione di primer per 5'-RACE PCR
NCBI Database nucleotidicoNCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
LINEE CELLULARI:
TM4 cellule di Sertoli murinoATCC, Manassas, VirginiaCRL-1715&commercio;
INSTRUMENTS:
LuminometerTurner BiosystemsTD-20/20Questo è un luminometro relativamente economico, azionato manualmente. Sono disponibili anche sistemi automatizzati dello stesso produttore che utilizzano piastre da 96 pozzetti.
Spettrofotometri NanoDropThermo Scientific, Inc.NanoDrop 2000può utilizzare quantità molto piccole di campione
DU 800 UV/VIS spettrofotometro e software per l'analisi degli acidi nucleici IIBeckmanCoulter Inc, Fullerton, CADU 800
Kit di dosaggio , di clonaggio TOPO TA, luciferasi, , Lo spettrofotometro

Riferimenti

  1. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
  2. Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
  3. Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
  4. Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
  5. Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
  6. Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
  7. Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
  8. Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
  9. Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
  10. Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
  11. Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
  12. Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
  13. Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
  14. Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
  15. Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
  16. Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
  17. Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
  18. Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
  19. Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
  20. National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
  21. Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
  22. New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
  23. Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
  24. Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
  25. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  26. VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
  27. Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
  28. Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
  29. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
  30. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  31. Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Gene Bcrp1Analisi in silicoSaggi reporterReporter della luciferasiIdentificazione degli esoniFunzionalit del promotoreGenoma del topoDatabase EST
I metodi per scoprire alternative Uso Promotore e regolazione trascrizionale di Murine Bcrp1
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.