Exosomal Analisi miRNA in non a piccole cellule del cancro del polmone (NSCLC) dei pazienti plasma attraverso qPCR: Un fattibile Liquido biopsia Strumento

Marco Giallombardo; Jorge Chacártegui Borrás; Marta Castiglia; Nele Van Der Steen; Inge Mertens; Patrick Pauwels; Marc Peeters; Christian Rolfo

doi:10.3791/53900

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Articolo metodologico

Exosomal Analisi miRNA in non a piccole cellule del cancro del polmone (NSCLC) dei pazienti plasma attraverso qPCR: Un fattibile Liquido biopsia Strumento

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DOI:

10.3791/53900

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27 maggio 2016

Marco Giallombardo^*¹^,² , Jorge Chacártegui Borrás^*²^,³ , Marta Castiglia⁴ , Nele Van Der Steen³ , Inge Mertens⁵^,⁶ , Patrick Pauwels⁷^,³ , Marc Peeters⁸^,³ , Christian Rolfo²^,³

¹Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, ²Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), ³Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, ⁴Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, ⁵Flemish Institute for Technological Research (VITO), ⁶CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, ⁷Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), ⁸Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la fattibilità di eseguire la profilazione dei miRNA negli esosomi, rilasciati nel plasma di pazienti con NSCLC, attraverso un kit commerciale di isolamento degli esosomi con trattamenti con proteinasi K e RNAsi, al fine di evitare la contaminazione dei miRNA circolanti e valutare le loro caratteristiche di biomarcatori nel NSCLC.

Abstract

La scoperta di alterazioni nei geni EGFR e ALK, tra gli altri, nel NSCLC ha guidato lo sviluppo di una terapia farmacologica mirata utilizzando inibitori selettivi della tirosin-chinasi (TKI). Per ottimizzare l'uso di questi TKI, è necessaria la scoperta di nuovi biomarcatori per la diagnosi precoce e la progressione della malattia. Questi esosomi isolati al plasma possono essere utilizzati come modo non invasivo e ripetibile per il rilevamento e il follow-up di questi biomarcatori. Come fonti di esosomi è stato utilizzato un ml di plasma di 12 pazienti con NSCLC, con diverse mutazioni e trattamenti (e 6 donatori sani come controlli). Dopo il trattamento con RNAsi, al fine di degradare i miRNA circolanti, gli esosomi sono stati isolati con un kit commerciale e risospesi in tamponi specifici per ulteriori analisi. Gli esosomi sono stati caratterizzati mediante western blotting per ALIX e TSG101 e mediante analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), le tecniche standard per ottenere dati biochimici e dimensionali di queste nanovescicole. L'estrazione dell'RNA totale è stata eseguita con un kit commerciale ad alto rendimento. A causa del contenuto limitato di miRNA negli esosomi, abbiamo deciso di eseguire la PCR retrotrascrizionale utilizzando un test individuale per ogni miRNA selezionato. Un pannello di miRNA (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), tutti correlati con la malattia da NSCLC, è stato analizzato sfruttando la notevole sensibilità e specificità dell'analisi Real-Time PCR; Il mir-1228-3p è stato utilizzato come controllo endogeno e i dati sono stati elaborati secondo la formula ^2-ΔΔct¹³. I valori di controllo sono stati utilizzati come base e i risultati sono mostrati in scala logaritmica.

Introduzione

Il basso tasso di sopravvivenza nel NSCLC (non a piccole cellule cancro ai polmoni) pazienti è dovuta principalmente alla limitata efficacia dei trattamenti di malattia avanzata e poveri diagnosi precoce ^1. Mutazioni attivanti nel gene EGFR, che sono stati scoperti in una sottopopolazione di pazienti con NSCLC, sono noti per conferire sensibilità agli inibitori della tirosin-chinasi (TKI). Purtroppo, la maggior parte dei pazienti con NSCLC EGFR mutanti sviluppare una resistenza TKI ^2. Soprattutto in questo contesto, una diagnosi corretta è obbligatoria. In generale, a causa della localizzazione dei tumori, l'ottenimento di tessuto b....