Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali

Ana Marcela Florez Rueda; Ueli Grossniklaus; Anja Schmidt

doi:10.3791/53916

Articolo metodologico

Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali

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DOI:

10.3791/53916

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10 maggio 2016

Ana Marcela Florez Rueda¹ , Ueli Grossniklaus¹ , Anja Schmidt¹

¹University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per la microdissezione laser-assistita di specifici tipi di cellule vegetali per la profilazione trascrizionale. Sebbene il protocollo sia adatto a diverse specie e tipi di cellule, l'attenzione si concentra sulle cellule altamente inaccessibili della linea germinale femminile, importanti per la riproduzione sessuale e apomittica nel genere delle crocifere Boechera.

Abstract

La comprensione dei processi di sviluppo a livello molecolare richiede approfondimenti sulla regolazione trascrizionale, e quindi sul trascrittoma, a livello dei singoli tipi di cellule. Mentre i metodi qui descritti sono generalmente applicabili a un'ampia gamma di specie e tipi di cellule, la nostra ricerca si concentra sulla riproduzione delle piante. La coltivazione delle piante e la produzione di sementi sono di fondamentale importanza per l'alimentazione umana e animale. Una comprensione dettagliata delle reti regolatorie che governano la formazione della linea riproduttiva (linea germinale) e, in ultima analisi, dei semi è una precondizione per la manipolazione mirata della riproduzione delle piante. In particolare, l'ingegnerizzazione dell'apomissia (riproduzione asessuata attraverso i semi) nelle piante coltivate promette grandi miglioramenti, in quanto porta alla formazione di semi clonali geneticamente identici alla pianta madre. Di conseguenza, i tipi cellulari della linea germinale femminile sono di grande importanza per la comprensione e l'ingegnerizzazione dell'apomissia. Tuttavia, poiché le cellule corrispondenti sono profondamente incorporate nei tessuti floreali, è molto difficile accedervi per le analisi sperimentali, compresa la trascrittomica specifica per tipo di cellula. Per superare questa limitazione, sezioni di singole cellule possono essere isolate mediante microdissezione laser-assistita (LAM). Sebbene la LAM in combinazione con la profilazione trascrizionale consenta l'identificazione di geni e percorsi attivi in qualsiasi tipo di cellula con elevata specificità, stabilire un protocollo adeguato può essere difficile. In particolare, la qualità dell'RNA ottenuto dopo LAM può essere compromessa, soprattutto quando si prendono di mira piccole cellule singole. Per aggirare questo problema, abbiamo stabilito un flusso di lavoro per LAM che si traduce in modo riproducibile in un'elevata qualità dell'RNA che è ben adatta per la trascrittomica, come esemplificato qui dall'isolamento di cellule della linea germinale femminile in Boechera apomittica. In questo protocollo vengono descritte le procedure per la preparazione dei tessuti e la LAM, anche per quanto riguarda l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità.

Introduzione

In studi trascrizionali fatto a livello dei tessuti, i trascrittomi di tipi di cellule altamente specializzate, ma rare sono spesso mascherati da i più abbondanti cellule circostanti. Un esempio di tali tipi di cellule altamente specializzate sono le cellule della linea riproduttivo femminile (germinale) in piante. La linea germinale femminile è specificato all'interno di ovuli in via di sviluppo, i precursori di semi all'interno del gineceo del ^1,2 fiore. La cellula madre megaspore (MMC) è la prima cellula della linea germinale femminile. Subisce meiosi per formare una tetrade di macrospora ridotti. Tipicamente, solo uno di questi macrospora sopra....