Articolo metodologico
L'abbondanza proteica riflette i tassi sia di sintesi proteica che di degradazione proteica. Questo articolo descrive l'uso del chase di cicloesimide seguito da western blotting per analizzare la degradazione delle proteine nell'eucariote unicellulare modello, Saccharomyces cerevisiae (lievito in gemmazione).
Regolamento di abbondanza di proteine è fondamentale per praticamente ogni processo cellulare. Proteina abbondanza riflette l'integrazione delle aliquote di sintesi proteica e la degradazione delle proteine. Molti saggi di relazioni su abbondanza di proteine (per esempio, in tempo unico punto western blotting, citometria a flusso, microscopia a fluorescenza, o saggi di crescita giornalista-based) non consentono la discriminazione degli effetti relativi di traduzione e proteolisi sui livelli di proteine. Questo articolo descrive l'uso di cycloheximide caccia seguita da Western blotting per analizzare specificamente degradazione delle proteine nel modello eucarioti unicellulari, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito). In questo procedimento, cellule di lievito vengono incubate in presenza di cicloesimide inibitore traduzionale. Aliquote di cellule vengono raccolte subito dopo e in punti temporali specifici seguenti aggiunta di cicloesimide. Le cellule sono lisate, e lisati sono separati da gel di poliacrilammide for analisi Western Blot di abbondanza di proteine in ogni punto. La procedura cicloeximide chase permette la visualizzazione della cinetica di degradazione della popolazione stato stazionario di una varietà di proteine cellulari. La procedura può essere utilizzata per studiare i requisiti genetici per e influenze ambientali sulla degradazione delle proteine.
Le proteine svolgono funzioni cruciali praticamente in ogni processo cellulare. Molti processi fisiologici richiedono la presenza di una specifica proteina (o proteine) per un determinato periodo di tempo o in particolari circostanze. Organismi quindi controllare e regolare l'abbondanza di proteine per soddisfare le esigenze cellulari 1. Ad esempio, cicline (proteine che controllano la divisione cellulare) sono presenti in specifiche fasi del ciclo cellulare, e la perdita di livelli di ciclina regolamentati è stata associata con la formazione di tumore maligno 2. Oltre a regolare i livelli di proteine per soddisfare le esigenze cellu....
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1. La crescita e Harvest delle cellule di lievito
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Per illustrare la metodologia caccia cicloesimide, la stabilità del Deg1 -Sec62 (figura 1), un substrato modello di lievito reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD), è stato analizzato 42-44. In ERAD, il controllo di qualità enzimi ubiquitina ligasi covalente attribuiscono catene del piccolo ubiquitina proteine di proteine aberranti localizzate alla membrana ER. Tali proteine polyubiquitylated vengono successivamente rimossi.......
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In questo documento, un metodo per analizzare la cinetica di degradazione delle proteine è presentato. Questa tecnica può essere facilmente applicata ad una gamma di proteine degradate da una varietà di meccanismi. È importante notare che gli esperimenti cicloesimide chase riferire sulla cinetica di degradazione del pool stato stazionario di una data proteina. Altre tecniche possono essere utilizzate per analizzare la cinetica di degradazione di specifiche popolazioni di proteine. Ad esempio, il destino di degradazi.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori ringraziano i membri attuali ed ex del laboratorio Rubenstein per aver fornito un ambiente di ricerca favorevole ed entusiasta. Gli autori ringraziano Mark Hochstrasser (Yale University) per la condivisione di reagenti e competenze. E.M.R. ringrazia Stefan Kreft (Università di Costanza) e Jennifer Bruns (Università di Pittsburgh) per aver condiviso la loro inestimabile esperienza nell'analisi cinetica delle proteine. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (R15 GM111713) a E.M.R., un premio per la ricerca ASPiRE della Ball State University a E.M.R., un premio per la ricerca dal capitolo della Ball State Universit....
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ceppi di lievito desiderati, plasmidi, terreni standard e componenti | |||
| Tubi monouso in vetro borosilicato | Fisher Scientific | 14-961-32 | Disponibile da una varietà di produttori |
| Incubatore a temperatura regolata (ad es. Incubatore Heratherm Modello IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Disponibile da una varietà di produttori |
| Tamburo intercambiabile New Brunswick per provette da 18 mm (rullo tubolare) | New Brunswick | M1053-0450 | per mantenere in sospensione colture starter di cellule di lievito durante la notte. In alternativa, se non è disponibile un rullo tubolare, è possibile utilizzare un agitatore a piattaforma in un'incubatrice a temperatura controllata per le colture starter notturne. Un agitatore a piattaforma o un rullo tubolare possono essere utilizzati per mantenere colture più grandi in sospensione. |
| New Brunswick TC-7 Tamburo a rulli 120 V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | Per l'uso con il rullo a tubo |
| Spettrofotometro SmartSpec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | Disponibile da una varietà di produttori |
| Centrifuga 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Il rotore venduto con l'unità contiene provette per microcentrifuga da 1,5 e 2,0 ml. Il rotore può essere sostituito con uno che contiene provette coniche da 15 e 50 ml |
| Rotore ad angolo fisso F-35-6-30 con coperchio e adattatori per centrifuga modello 5430/R, provette coniche da 15/50 ml, 6 posti | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| tappo a vite serigrafato da 15 ml 17 x 20 mm, polipropilene | Sarstedt | 62.554.205 | Disponibile da una varietà di produttori |
| Tubo flessibile da 1,5 ml, Provette per microcentrifuga naturali e pulite per PCR | Eppendorf | 22364120 | Disponibile presso una varietà di produttori |
| Riscaldatori analogici per Dri-Bath Fisher | Scientific | 1172011AQ | Si raccomanda di avere a disposizione due riscaldatori (uno per l'incubazione delle cellule durante il trattamento con cicloesimide e uno per l'ebollizione dei lisati per denaturare le proteine). In alternativa, 30 ° Il bagnomaria C può essere utilizzato per l'incubazione di cellule in presenza di cicloesimide. Il bagno d'acqua bollente con piastra calda può essere utilizzato alternativamente per denaturare le proteine. |
| Blocco riscaldante per 12 provette coniche da 15 ml | Fisher Scientific | 11-473-70 | Da utilizzare con il riscaldatore per bagno driico durante l'incubazione di cellule in presenza di cicloesimide. |
| Blocco riscaldante per 20 provette coniche da 1,5 ml | Fisher Scientific | 11-718-9Q | Da utilizzare con il riscaldatore Dri-Bath per bollire i lisati per la denaturazione delle proteine. |
| SDS-PAGE apparecchiature di esecuzione e trasferimento, alimentatori e apparecchiature di imaging o camere oscure per SDS-PAGE e trasferimento su membrana | Varierà in base al laboratorio e all'applicazione | ||
| Sistema di imaging Western blot (ad es. Li-Cor Odyssey CLx scanner e Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Varierà in base al laboratorio e all'applicazione |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Membrane di trasferimento | Fisher Scientific | IPFL00010 | Varia in base al laboratorio e all'applicazione |
| Anticorpi primari (ad es. Fosfoglicerato chinasi (Pgk1) Anticorpo monoclonale, topo (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Varia in base al laboratorio e all'applicazione |
| Anticorpi secondari (ad es Alexa-Fluor 680 IgG anti-topo di coniglio (H + L)) | Life Technologies | A-21065 | Varia in base al laboratorio e all'applicazione |
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