Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare l'isolamento e coltura tecniche di cellule muscolari murine primarie lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica. Una volta VSMC sono stati isolati, essi possono essere utilizzati per vari tecniche di coltura standard.
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Articolo metodologico
L'isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) da navi di grandi dimensioni è ben definito, abbiamo cercato di isolare e la cultura VSMC dalla circolazione coronarica. Cuori con archi aortici intatti sono stati rimossi e perfusi via Langendorff retrograda con una soluzione di digestione contenente 300 unità / ml di collagenasi di tipo II, 0,1 mg / inibitore della tripsina di soia ml e 1 M CaCl 2. Le perfusates sono stati raccolti a 15 min intervalli di 90 minuti, pellet per centrifugazione, risospese in terreni in piastra, e placcato su piatti di coltura di tessuti. VSMC sono stati caratterizzati da presenza di SM22α, α-SMA, e vimentina. Uno dei principali vantaggi di utilizzare questa tecnica è la capacità di isolare VSMC dalla circolazione coronarica di topi. Sebbene il piccolo numero di cellule ottenute possono limitare alcune delle applicazioni per le quali possono essere utilizzate le cellule, isolate VSMC coronarie può essere utilizzato in una varietà di tecniche di coltura cellulare consolidate e assays. Gli studi che indagano VSMC da topi geneticamente modificati in grado di fornire ulteriori informazioni sulla struttura-funzione e dei processi di segnalazione associati a patologie vascolari.
Introduzione
L'obiettivo di questo metodo è quello di isolare le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica murino per l'impiego in colture cellulari e saggi standard di coltura cellulare. Abbiamo sviluppato questa tecnica per valutare i meccanismi molecolari di rimodellamento vascolare nel diabete. Abbiamo precedentemente riportato verso l'interno rimodellamento ipertrofico nelle arteriole coronariche del setto nel modello di topo db / db di diabete 1. A causa della limitata quantità di tessuto che si trova nelle coronarie setto murini, tecniche sperimentali standard di indagare variazioni proteiche (es Western blot) in....
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Protocollo
Etica Dichiarazione: Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute, ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzione Usa all'ospedale dei bambini a livello nazionale.
1. Preparazione / Impostazione
Nota: Questa tecnica di isolamento richiede due bobine di riscaldamento Langendorff posizionate fianco a fianco su un supporto ad anello, e collegato in parallelo ad un bagno di acqua circolante.
- Attiva bagno di acqua circolante e regolare la temperatura a una temperatura finale di 33-34 ° C sulla punta della cannula Langendorff (bagno acqua utilizzata in questa confi....
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Risultati
Grazie al nuovo aspetto della nostra tecnica di isolamento VSMC coronarica, abbiamo cercato di determinare la purezza del isolamento delle cellule. Mouse VSMC coronarici sono stati identificati in base alla loro morfologia e immunofluorescenza fino a passaggio 2. Sulla base della morfologia delle cellule in coltura dopo il primo lavaggio, la procedura di isolamento rimuove efficacemente miociti cardiaci e cellule endoteliali. Le VSMC mantengono la loro morfologia fino a passaggio 2
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Discussione
Lo scopo di questo studio è stato quello di adattare i protocolli di isolamento delle cellule esistenti per aumentare la resa della coronaria liscia vascolare dai cuori murini. La maggior parte del lavoro pionieristico nella biologia vascolare muscolatura liscia è stata eseguita con le cellule muscolari lisce in coltura ratto aortica. Questi studi hanno fornito conoscenze fondamentali dei meccanismi molecolari che controllano la crescita VSMC, la migrazione e l'ipertrofia 7. Tuttavia, come il campo progre.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01HL056046 PAL e K99HL116769 a AJT), e L'Istituto di ricerca all'ospedale dei bambini di Nationwide (PAL e AJT).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siero fetale bovino | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M soluzione | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (alto glucosio, piruvato di sodio, L-glutammina) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Filtro cellulare sterile 100 &; m rete di nylon | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Piatto in polistirolo con coperchio, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus sutura di seta nera 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenasi Tipo-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Inibitore della tripsina di soia 25 mg | Sigma | T6522 | |
| salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1x), liquido (trasparente) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1x), liquido (rosso fenolo) | Life Technologies | 14170-161 | |
| Serpentina di riscaldamento da 5,0 ml con trappola per bolle di degasaggio | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pompa | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Pompa | funzionerà di qualsiasi marca |
Riferimenti
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al.
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Ristampe e permessi
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