Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare l'isolamento e coltura tecniche di cellule muscolari murine primarie lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica. Una volta VSMC sono stati isolati, essi possono essere utilizzati per vari tecniche di coltura standard.
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Articolo metodologico
L'isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) da navi di grandi dimensioni è ben definito, abbiamo cercato di isolare e la cultura VSMC dalla circolazione coronarica. Cuori con archi aortici intatti sono stati rimossi e perfusi via Langendorff retrograda con una soluzione di digestione contenente 300 unità / ml di collagenasi di tipo II, 0,1 mg / inibitore della tripsina di soia ml e 1 M CaCl 2. Le perfusates sono stati raccolti a 15 min intervalli di 90 minuti, pellet per centrifugazione, risospese in terreni in piastra, e placcato su piatti di coltura di tessuti. VSMC sono stati caratterizzati da presenza di SM22α, α-SMA, e vimentina. Uno dei principali vantaggi di utilizzare questa tecnica è la capacità di isolare VSMC dalla circolazione coronarica di topi. Sebbene il piccolo numero di cellule ottenute possono limitare alcune delle applicazioni per le quali possono essere utilizzate le cellule, isolate VSMC coronarie può essere utilizzato in una varietà di tecniche di coltura cellulare consolidate e assays. Gli studi che indagano VSMC da topi geneticamente modificati in grado di fornire ulteriori informazioni sulla struttura-funzione e dei processi di segnalazione associati a patologie vascolari.
Introduzione
L'obiettivo di questo metodo è quello di isolare le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica murino per l'impiego in colture cellulari e saggi standard di coltura cellulare. Abbiamo sviluppato questa tecnica per valutare i meccanismi molecolari di rimodellamento vascolare nel diabete. Abbiamo precedentemente riportato verso l'interno rimodellamento ipertrofico nelle arteriole coronariche del setto nel modello di topo db / db di diabete 1. A causa della limitata quantità di tessuto che si trova nelle coronarie setto murini, tecniche sperimentali standard di indagare variazioni proteiche (es Western blot) in topi db / db e controllo sono meno difficile. Inoltre, abbiamo già dimostrato che l'antagonista del recettore dell'angiotensina (ARB) losartan riduce il rimodellamento osservato nei topi db / db 2. Pertanto, l'isolamento di VSMCs primarie dalla circolazione coronarica ci permette di indagare ulteriormente cambiamenti nel fenotipo VSMC o vie di segnalazione attivati in topi diabetici, che possono essere contribuTing a negativo rimodellamento arteriole coronariche.
Numerosi studi hanno chiarito vie di segnalazione canoniche utilizzando VSMC isolate da aorta di roditori, piuttosto che in ogni letto vascolare specifica. Tuttavia, abbiamo dimostrato vascolare letto rimodellamento specifico coronarica, aortica, e circolazioni mesenteriche di topi db / db 1, suggerendo le VSMC in ogni letto vascolare può essere diverso. Pertanto, è necessario isolare VSMC da ogni letto vascolare per comprendere meglio i cambiamenti patologici che si verificano in ciascun gruppo di VSMC. Ci sono una pletora di diversi metodi per isolare e coltura VSMCs aortica. Tuttavia, attualmente, vi è un solo studio che è stato pubblicato l'isolamento di VSMC dal mouse circolazione coronarica 3. Teng et al. fu il primo a segnalare un metodo per isolare VSMCs dalla circolazione coronarica del mouse; tuttavia, abbiamo modificato in modo significativo il protocollo in quanto anche isolati cel endotelialeLS. Altri laboratori hanno anche utilizzato il protocollo da Teng et al. Isolare miociti arteriosi coronarici e delle vie aeree cellule muscolari lisce 4,5. Le alterazioni abbiamo incorporato produrrà una popolazione di cellule altamente arricchito per VSMCs dalla circolazione coronarica.
La perfusione retrograda del cuore dei mammiferi isolato, o la tecnica Langendorff, è stata fondata nel 1897 da Oscar 6 Langendorff ed è ancora ampiamente usato oggi per l'isolamento delle cellule cardiovascolari. La tecnica qui presentata, insieme con l'avanzamento delle moderne modificazioni genetiche murine, fornisce uno strumento prezioso per studiare più da vicino il comportamento molecolare VSMCs dalla circolazione coronarica.
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Protocollo
Etica Dichiarazione: Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute, ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzione Usa all'ospedale dei bambini a livello nazionale.
1. Preparazione / Impostazione
Nota: Questa tecnica di isolamento richiede due bobine di riscaldamento Langendorff posizionate fianco a fianco su un supporto ad anello, e collegato in parallelo ad un bagno di acqua circolante.
- Attiva bagno di acqua circolante e regolare la temperatura a una temperatura finale di 33-34 ° C sulla punta della cannula Langendorff (bagno acqua utilizzata in questa configurazione è impostato a 40 ° C a causa di una perdita di 6-7 ° C di temperatura attraverso tubi). Accendere le pompe di perfusione e impostare tasso di perfusione a 0,5 ml / min.
- Pulire entrambe le serpentine di riscaldamento con camicia d'acqua, tubi allegato e 25 cannula calibro da vampate di calore ciascuno con 50 ml di etanolo al 70%, seguita da 100 ml di acqua ultrapura in autoclave.
- Cancellare le serpentine di riscaldamentospingendo aria con una siringa e lavare con 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza rosso fenolo. Lasciare HBSS nelle serpentine di riscaldamento e tubi.
- Attaccare sterile 10 ml luer-lock siringa riempita con temperatura ambiente HBSS senza rosso fenolo al tubo. Assicurarsi che non bolle d'aria intrappolate all'interno delle serpentine di tubi e di riscaldamento quando si collega la siringa HBSS-riempita in quanto ciò potrebbe causare embolia aria durante la digestione di un impatto negativo l'isolamento VSMC.
- Rimuovere la cannula calibro 25 dalle serpentine di riscaldamento e posto su un altro sterile siringa da 10 ml pieno di ghiaccio-freddo HBSS senza rosso fenolo. Tenere questo in ghiaccio fino al momento dell'uso. Ripetere per l'altra cannula.
- Preparare Digestione enzimatica Solution.
- Pesare collagenasi di tipo 2 in base al numero di lotto specifico per 75 ml di soluzione di digestione per ottenere una concentrazione finale di 300 unità / ml.
- Sciogliere collagenasi in 75 ml di HBSS con rosso fenolo. Successivamente, aggiungere 1,5 ml di 0.1 Mg / inibitore della tripsina di soia ml e 75 ml di 1 M CaCl 2 alla miscela.
- Se si utilizza immediatamente la soluzione di digestione, riscaldarlo a 37 ° C. In caso contrario, è posto a 4 ° C per un massimo di 6 ore. Questa soluzione deve essere fatto fresco ogni giorno.
- Preparare il supporto soluzione di stop / placcatura.
- Aggiungere 100 ml inattivato al calore FBS, 5 ml di L-glutammina, 5 ml di aminoacidi non essenziali, 5 ml di HEPES, e 1 ml di primocin a 500 ml di glucosio (4,5 g / L) DMEM. Si raccomanda filtro di sterilizzazione.
- Aliquota 6 ml di soluzione di stop in ciascuno dei dodici 15 ml provette coniche, numerati A1-A6 e B1-B6, e posto a 4 ° C. Aliquota 50 ml di soluzione di stop in una conica da 50 ml e posto nel 37 ° C incubatore.
Nota: Questo passaggio può anche essere preparata il giorno prima l'isolamento, se necessario. Questa soluzione di arresto sarà utilizzata come i mezzi di comunicazione di placcatura seguenti isolamento delle cellule.
- Preparare due 1 ml siringhe dotate di un ago G 30con 100 ml di eparina (1.000 unità / ml).
- Tagliare un pezzo 5 cm di 5-0 seta chirurgica. Tie un nodo semplice allentato nella seta chirurgica con una estremità due volte finchè l'altro. Posizionare sulla cannula 25-gauge, ma non stringere. Ripetere l'operazione per l'altro 25 G cannula.
- Riempire quattro 35 mm piastre di Petri sterili (# 1-4) con 2 ml di sterili, ghiacciata, HBSS senza rosso fenolo. Tenere in ghiaccio.
2. L'eutanasia, Isolamento Cuore e Incannulamento
- Prima di isolamento del cuore, in modo che la soluzione digestione e 50 ml conica della soluzione di stop sono caldi. Rimuovere la siringa HBSS-riempita con annesso 25 G cannula dal ghiaccio e posto in un morsetto buretta (o morsetto supporto ad anello) su un supporto ad anello.
- Anestetizzare topo, utilizzando 3% isofluorane. Confermare il mouse è anestetizzato da un tocco dito su ogni arto posteriore. Se le contrazioni delle gambe, il mouse non è ancora anestetizzato in modo da attendere 1 minuto e ripetere il tocco con la punta.
- Esporre la vena giugulare rimuovendo pelliccia unpelle nd sulla anteriore del collo con le forbici. Successivamente, utilizzare pinze per rimuovere accuratamente qualsiasi grasso che circonda la vena giugulare. Dopo la rimozione di grasso, iniettare lentamente 100 ml di eparina (1.000 unità / ml). Posizionare una spugna chirurgica sopra la vena al fine di evitare un eccessivo sanguinamento.
- Dopo 1 minuto, a torace aperto per esporre il cuore, il cuore di sollevamento con pinze curve e delle accise che con le forbici, evitando di mettere l'aorta ascendente intatta attraverso il primo ramo brachiocefalica. Immediatamente posto il cuore in un piatto 35 mm (1 #) con ghiaccio-freddo HBSS senza rosso fenolo e risciacquare.
Nota: eseguire i seguenti 4 passaggi utilizzando un ambito dissezione. - Posizionare il 25 G cannula che è montato sull'anello troviamo in un angolo di 45 ° in modo che la punta si trova appena sotto la superficie ghiacciata HBSS in piatto # 2 ed è chiaramente visibile attraverso il microscopio da dissezione. Trasferire il cuore di piatto # 2.
- Utilizzando pinze Dumont, esporre l'aorta, rimuovendo delicatamente eccesso adiposo via smussa di ppuntura revent o lacerazione dell'aorta. Successivamente, utilizzare una pinza per far scorrere l'aorta sopra la G cannula 25.
- Guida la cannula verso il basso attraverso l'aorta, vicino a, ma non oltre la valvola aortica, che compromettere l'integrità della valvola e di conseguenza, la perfusione retrograda. Una volta che la cannula è a posto, far scorrere la seta pre-legato sopra l'aorta, e stringere. Legare un secondo nodo per formare un nodo quadrato intorno all'aorta per fissare il cuore.
- Una volta che l'aorta è legato in modo sicuro, lavare delicatamente il sangue rimanente dalla circolazione coronarica con il ghiaccio-freddo HBSS nella siringa attaccata alla cannula di G 25. Fare attenzione a non spingere troppo per evitare un'eccessiva pressione coronarica. E 'richiesto solo un colore molto lento e delicato per completare il colore. incannulazione aortica senza perdite può essere osservato anche durante questo delicato filo.
- Accendere la pompa di perfusione per iniziare il flusso di HBSS. Rimuovere il G cannula 25 (con il cuore in allegato) dalla siringa HBSS-riempita, avendo cura dimantenere il mozzo della cannula piena di HBSS, e collegarlo ai caldi serpentine di riscaldamento HBSS-riempite. Iniziare perfusione del cuore con la pompa di perfusione ad una velocità di 0,5 ml / min per 8 min.
- Dopo il primo cuore è cannulata e viene perfuso sul sistema, ripetere i passaggi 2,1-2,8 per il secondo cuore. Questi isolamenti saranno scaglionati per ogni cuore quindi un'attenta pianificazione e la tempistica sono necessari.
3. Digestione
- Dopo lavaggio con HBSS, cambiare lo 10 ml HBSS siringa attualmente sul pompa uno riempito con 10 ml di soluzione di digestione pre-riscaldato. Profumato ogni cuore con soluzione di digestione per 12 minuti ad una velocità di 0,5 ml / min. Non raccogliere frazioni derivanti da questa prima digestione come questo conterrà il sangue residuo e le cellule endoteliali.
- Dopo 12 min, modificare la velocità di perfusione a 0,4 ml / min, posizionare una conica 15 ml (tubo A1 o B1, corrispondente al primo o secondo cuore per ogni digestione) riempito con solut arresto freddaione in un secchio di ghiaccio sotto il cuore, al fine di iniziare la raccolta perfusato VSMC arricchito.
- Dopo 15 min, modificare la conica raccolta per tubo o tubo A2 B2 e centrifuga conica A1 e B1 a 89 xg per 10 min immediatamente dopo la raccolta di entrambe le frazioni. Quando la siringa riempita con la soluzione di digestione sulla pompa ha meno di 1 ml di soluzione, sostituirlo con un appena siringa preriempita 10 ml di soluzione di digestione.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante da ogni tubo di raccolta, lasciando circa 0,5 ml. Risospendere il pellet da A1 con 2 ml di soluzione di arresto calda (o supporto placcatura). Aggiungere risospensione dal tubo A1 a tubo B1 e luogo tubo nel 37 ° C incubatore con il tappo allentato.
- Ripetere i punti 3.3 e 3.4 fino a quando tutti i tubi (attraverso la A6 e B6) sono utilizzati per un tempo di raccolta totale di 90 min. A 80 min di digestione, tagliare aprire l'apice del cuore per scovare eventuali cellule che potrebbero essere intrappolate all'interno del ventricolo e raccogliere queste cellule in A6 tubo e B6, faucibusctively.
Nota: Di tanto in tanto il cuore cadrà la cannula prima del punto di tempo di 90 min. In questo caso, recuperare il cuore e posto in una sterile 35 millimetri piastra di Petri riempite con 2 ml di soluzione di digestione. Tagliare l'apice del cuore e lavare delicatamente il cuore con soluzione di digestione. Poi, filtrare i 2 ml di soluzione di digestione attraverso una sterile 100 micron colino cella in una conica 50 ml e aggiungere alla A6 tubo o B6. - Dopo ogni giro di tubi successivi (A2 e B2), aggiungere le VSMC risospesa per il tubo di raccolta precedente (combinato A1 e B1). Inoltre, fare attenzione a non lasciare che la soluzione di digestione nella pompa esaurito e passare i 10 ml siringhe, se necessario durante la digestione.
- Dopo che tutti i tubi sono combinati, centrifugare la sospensione ricco VSMC a 89 xg per 10 min.
- Aspirare tanto surnatante dai tubi di raccolta il più possibile. Risospendere il pellet residuo in 2 ml di placcatura media e piatto su un piatto di coltura da 35 mm. Luogo cultura piatto hon 37 ° C incubatore per 24 ore.
Cultura 4. cellulare
Nota: Completare i passaggi rimanenti nel cabinet biosicurezza.
- Dopo 24 ore, aspirare delicatamente il supporto di placcatura. La cultura avrà normalmente una grande quantità di detriti. Per lavare le cellule, aggiungere 2 ml di caldo, PBS sterile e toccare delicatamente il piatto contro due dita durante la rotazione in senso orario.
- Dopo la rotazione di 360 °, aspirare il PBS e ripetere una seconda volta. Aspirare il PBS e aggiungere un altro 2 ml di sterili, caldo PBS. Controllare il piatto cultura sotto il microscopio per assicurarsi che non vi è poca o nessuna detriti sulla piastra. Cellulare confluenza può essere determinato anche in questo momento.
- Se i detriti rimane nel piatto cultura, ripetere il punto 4.2. Se il piatto cultura è privo di detriti, aspirare il PBS e aggiungere 2 ml di terreni in piastra calda.
- Dopo 24 ore, lavare le cellule di nuovo con il caldo, PBS sterile per rimuovere eventuali detriti finale o le cellule morte dalla cultura. Aspirare il PBS e ppizzo altri 2 ml di media placcatura calda sulle cellule.
- Controllare sulle cellule ogni giorno e mangiare ogni 48 ore con i media placcatura riscaldati freschi. A questo punto, le cellule possono essere utilizzate per saggi standard di coltura cellulare. VSMC dovrebbero essere circa l'80% confluenti 4-5 giorni dopo la placcatura, anche se può richiedere fino a 7 giorni fino a quando la procedura si perfeziona. Se la divisione di passaggi successivi, utilizzare un massimo di 1: 4 35 piatti mm (o in una zona comparabile di piatti della cultura).
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Risultati
Grazie al nuovo aspetto della nostra tecnica di isolamento VSMC coronarica, abbiamo cercato di determinare la purezza del isolamento delle cellule. Mouse VSMC coronarici sono stati identificati in base alla loro morfologia e immunofluorescenza fino a passaggio 2. Sulla base della morfologia delle cellule in coltura dopo il primo lavaggio, la procedura di isolamento rimuove efficacemente miociti cardiaci e cellule endoteliali. Le VSMC mantengono la loro morfologia fino a passaggio 2
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Discussione
Lo scopo di questo studio è stato quello di adattare i protocolli di isolamento delle cellule esistenti per aumentare la resa della coronaria liscia vascolare dai cuori murini. La maggior parte del lavoro pionieristico nella biologia vascolare muscolatura liscia è stata eseguita con le cellule muscolari lisce in coltura ratto aortica. Questi studi hanno fornito conoscenze fondamentali dei meccanismi molecolari che controllano la crescita VSMC, la migrazione e l'ipertrofia 7. Tuttavia, come il campo progre...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01HL056046 PAL e K99HL116769 a AJT), e L'Istituto di ricerca all'ospedale dei bambini di Nationwide (PAL e AJT).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siero fetale bovino | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M soluzione | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (alto glucosio, piruvato di sodio, L-glutammina) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Filtro cellulare sterile 100 &; m rete di nylon | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Piatto in polistirolo con coperchio, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus sutura di seta nera 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenasi Tipo-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Inibitore della tripsina di soia 25 mg | Sigma | T6522 | |
| salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1x), liquido (trasparente) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1x), liquido (rosso fenolo) | Life Technologies | 14170-161 | |
| Serpentina di riscaldamento da 5,0 ml con trappola per bolle di degasaggio | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pompa | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Pompa | funzionerà di qualsiasi marca |
Riferimenti
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