The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
담배 연기 (CS)은 심혈관 및 폐 질환의 주요 위험 인자이다. CS는 전반적인 독성 개별 구성 요소의 기여를 평가하기 위해 도전 1 7,000 개 이상의 화학 물질을 포함하는 복잡한 에어로졸이기 때문이다. 미국 식품의 약국에 의해 정의 된 개별 구성 요소뿐만 아니라 혼합물의 독성 프로파일 그러나, 관통 넣어 담배 연기의 유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분 (HPHCs)의 프로파일 링을 가능하게 선별 도구, 높은 적용하여, 시험관 내에서 설정 될 수있다 청 (FDA). (2)
초기 평가, 임피던스 기반 장비가 화합물의 독성을 실시간으로, 라벨없는 평가에 사용 하였다. 기기의 판독은 모두 함께 세포 상태의 개요를 제공하는 세포 접착, 생존 및 형태에 의존합니다. 셀 인덱스라는 차원 매개 변수는, 정량에 사용됩니다. DIF의 집합ferent 염색 프로토콜은 형광 이미징 기반 조사 개발 및 HCS 플랫폼은 각 HPHC 의해 유도 독성의 종류에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해 사용되었다.
그들은 계산 가능한 LD 50 (<20 mm)를 등록 된 시험 15 성분 중 다섯은 HCS 기반 분석을 위해 선정되었다. 이들은 1 aminonaphtalene, 비소 (V), 크롬 (VI), 크로톤 알데히드 및 페놀을 포함했다. HCS에 미치는 영향에 기초하여, 1 aminonaphtalene 페놀이 증가 히스톤 H2AX 인산화에 기초 유전 독성과 같은 크롬 (VI)와 함께, 미토콘드리아의 기능 장애를 유도하는 것으로 확인 될 수있다. 크로톤은 스트레스 키나아제 경로 활성제로서 산화 스트레스 유발 비소로 확인되었다.
본 연구는 임피던스 기반 HCS 기술의 조합 CS 성분의 시험 관내 평가를위한 강력한 수단을 제공한다는 것을 보여준다.
독성 위험 평가는 역사적 생명 과학에 기초하지만, 또한 인간과 고비용으로 일관 번역 가능성 단점으로 연결되며, 동물 모델의 사용에 의존 하였다. 또한,는 "3RS"이 (대체, 감소 및 정제)의 정신에서 동물 실험의 대안을 찾을 수 증가 노력이 있었다. 이러한 노력은 지난 몇 년 동안 가속화되었다뿐만 아니라 때문에 특히 유럽 연합 (EU)의 높은 처리량 기술과뿐만 아니라, 때문에 동물 실험의 사용을 제한하는 법률의 시스템 생물학 접근 방식으로 최근의 진보,의.
욕설 독성에 대한 반응을 조절 세포 신호 전달 경로의 복잡성은 하나의 독성 엔드 포인트를 사용하여 특정 화합물의 독성 학적 근거를 설명하는 데 충분하지 않을 것이라는 것이 명백한다. 이를 위해 상호 P 수백 상호생물학적 네트워크에 기여 roteins도 고려 될 필요가있다. 이러한 네트워크에서 독성 물질의 효과를 연구하기 위해, 표현형 중간 및 높은 처리량 스크리닝 분석과 결합 시스템 독성 접근 역가를 추정 함과 동시에 각각의 독성 물질의 작용 기전에 대한 추가 정보를 제공하는 것이 유용하다.
본 연구에서는 취득 처리 및 특정 형광 기반 세포 분석으로부터 유도 된 화상 데이터를 분석 할 수있는 자동화 현미경 및 생물학적 소프트웨어 애플리케이션 구성되어 강력한 선별 도구으로 HCS를 사용. 이 단일 세포 또는 세포 내 수준에서 정량 셀 내의 시각적 인 변화를 허용하고, 다수의 파라미터가 동시에 분석한다. (3) 예를 들어, DNA 이중 가닥 나누기 히스톤 H2AX 인산화의 항체 – 기반 식별자를 사용하여 평가하고, 반응성 산소 종 (ROS)은 셀 파마하여 정량화eable 슈퍼 옥사이드 민감한 염료.
폐 상피 세포가 담배 연기를 포함하여 흡입 독성 물질,에 대해 첫 번째 생물학적 장벽을 나타 내기 때문에, 우리는 미국 식품의 약국 (FDA)에 의해 출판 HPHCs의 효과를 프로파일 체외 모델 1 차 기관지 상피 세포를 이용했다. 4이 원고의 후속이다 우리가 HPHCs의 다른 부분 집합의 생물학적 영향을 평가하는 이전의 연구 5 – 최대.
체외에서 세포 독성을 평가하는 워크 플로우의 일환으로, 우리는 처음에 우리가 다음 HCS에 적합한 용량 범위를 설정할 수 (RTCA) 시스템 임피던스 기반의 실시간 세포 분석을 사용하여, 15 HPHC의의 선택의 효능을 평가 분석 (그림 1). 다음 세포 독성 구 파라 메트릭 다중 엔드 포인트를 이용하여 수행 하였다 HCS 독성 평가는, 각각 두 개의 시점 (4 및 24 시간)에서 모니터. 표 1에 기재된 바와 같이 7 활성, 시토크롬 C 분리와 세포막 투과성 – 사용 된 마커는 미토콘드리아 독성, DNA 손상, 스트레스 키나아제 활성 산소 종 (ROS), 글루타치온 (GSH) 함량, 카스파 제 3 지시 하였다.
우리의 접근 가능 식별 및 투여 량 및 시간 의존적 샘플링 통해 담배 연기 성분의 효과의 특성화. 궁극적으로, 이것은 각 HPHC 대한 시험 관내 독성 프로파일을 만들었다. 멀티 오 믹스 방식은 상기 HCS 분석을 보완 할 수있다. 이것은 결국에는 세포 신호 및 / 또는 전사 수준에서의 효과의 깊은 이해를 제공한다.
동물 실험의 대안에 대한 새로운 높은 처리량 테스트 방법에 대한 요구가 널리 지난 몇 년 동안 논의되어왔다. 이 밀접하게 표적 조직의 생리를 모방 세포 분석을 이용하여 표준 독성 시험에 대한 대체 방법을 조사하기 위해 과학자들과 규제 당국을 주도하고있다. 본 연구는 인간의 폐 상피 세포의 단일 CS 성분에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해 고 함량의 스크리닝 (HCS) 플랫폼 실시간 세포 분석기 (RTCA)를 조합의 적용을 설명했다. 이 설정은 유사 각종 공기 오염, 부유 입자 및 나노 입자에 의해 유도 된 세포 독성을 평가하기 위해 적용될 수있다. 또한, 얻어진 결과는 인과 생물학적 네트워크에 기초하여 전체 게놈 transcriptomics 및 계산 방법의 것과 일치 할 수있다. 이전에보고 된 바와 같이,이 방법은 분자 경로에 대한 데이터를 확증하기 위해 우리를 허용HCS 엔드 포인트와 CS 노출 5시 섭동, 또한 표현형이 경로의 교란을 해결.
흐름도 분석으로 실시간 세포 분석 량과 노출 시점 하류 분석 (14)에 대한 바람직한 수있다 나은 의사 결정을 할 수있는 투여 량 및 시간 의존적 해상도에서 세포 생존과 관련된 정보를 제공한다. 분석기의 원리들은 금 미세 덮여 배양 웰의 표면 상에 부착 확산으로 세포에 의해 생성 된 온 저항의 변화에 의존한다. 임피던스 궁극적 형태 및 세포 생존, 확산, 세포 접착 성을 모니터링하는 데 사용할 수있는 셀 인덱스라는 무 차원 파라미터로 변환된다. 이 기술은 세포 독성 기전에 대한 정보를 제공하지 않지만, 감도에도 HCS 유익하지 않은 아주 낮은 용량에서 세포 형태의 변화를 검출 가능하게 (데이터는 보이지 않음). previ을 바탕으로OU를 실험, 우리는 RTCA 방법은 HCS 엔드 포인트에 비해 낮은 용량에서 형태 학적 변화를 감지 할 수 있다고 지적했다.
실시간 세포 분석기 초기 스크리닝 다음하는 HCS 플랫폼은 각 HPHC 의해 유도 독성의 종류에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해 사용되었다. 세포 구획에 미치는 잠재적 인 영향으로 HPHCs을 프로파일 허용 HCS 분석 패널 / 세포 기관뿐만 아니라 유전 독성 또는 산화 스트레스를 유도 사람들을 식별하는. 분석은 선택 HPHCs가 NHBE 세포에서 세포 독성을 유도함으로써 서로 다른 프로파일을 밝혔다. 일반적으로, 모든 화합물은 페놀을 제외하고 가장 높은 시험 용량으로 괴사를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 잠재적 인 유전 독성에 대한 마커로 H2AX의 암 발생 1 aminonaphtalene에 의한 인산화의 역할, 그러나 미토콘드리아 독성 판독이 HPHC의도 폭로 활동 HCS 패널 (질량 증가 시토크롬 C의 relea과 일치SE) 및 산화 스트레스 (GSH 고갈). 전술 한 바와 마찬가지로, 페놀 미토콘드리아의 기능 장애를 유발하고, DNA 손상과 GSH의 고갈을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 크롬 (VI), 그룹 I 발암 물질로 분류되는 화합물 중 하나, 및 크로톤은 모두 특히 크롬 (VI) 또한, 세포 사멸을 유도 (카스파 제 캐스케이드의 활성화) 및 크로톤에서 ROS 생성을 증가 야기 같은 유전 독성을 확인 하였다. 마지막으로 비소 (V)은, 스트레스 키나아제 경로의 활성화 마커 cJun 인산화를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
본 연구는 시험관 내에서 상피 세포 폐암 모델로 NHBE 세포를 이용했다. HCS 설정에서이 세포를 사용하는 것은 전례가 및 유전 독성 및 산화 스트레스 마커를 포함하는 엔드 포인트의 넓은 범위의 조사를 활성화. 생균 고정 세포 염색 방법 모두 전반적인 기술의 유연성을 보여 우리 프로토콜에서 설명 하였다. F에서행위는, 아주 동일한 프로토콜은 형광 염료 또는 항체의 사용에 의해 해결 될 수있는 대상의 넓은 범위에 적용될 수있다. 라이브 염색 프로토콜을 성공적으로 실행하기 위해, 상기 염료 중 일부가 한정된 반감기와 화상 획득이 완료되기 전에 감소 할 수 형광 신호를 같이 배양 시간을 존중하는 것이 중요하다. 이는 다른 세포 유형이 사용되면, 모든 염색 조건에 최적의 염료 농도, 재평가되어야하며 배양 시간은 상이 할 수 있음을 고려하는 것도 중요하다.
현재 논문에서는 다섯 화합물은 HCS 방법으로 상영 시나리오를 설명했다. 전술 플레이트 배치를 고려하면, 그들은 이에 이상의 화합물 또는 동시 스크리닝 수 24 판 (6 세이 2 시간 점) 판 국지적 수는 증가 될 수있는 총 2 개 이상의 서로 다른 플레이트 세트를 투여했다 inves의이상의 엔드 포인트의 tigation. 그렇게하기에 앞서 하나의 특정 종점 (GSH 및 ROS)이 즉시 획득을 필요로하는 것이 고려되어야하고, 그 결과, 판의 투여 이전 판의 획득을 허용하는 지그재그 방식으로 수행되어야한다. 플레이트는 이후 단계에서 염색 절차를 완료하기 위해, 정착 후의 어떤 단계에서 프로토콜을 방해하는, 적층 될 수있는 반면에, 고정 된 세포 염색 프로토콜을 사용하는 장점을 나타낸다. 이러한 접근법은, 예를 들면, 데이터의 품질을 손상시키지 않고 모든 생균 착색 판을 작성하는 시간과 운전자에게 제공한다.
상기 판의 수를 감소시킴으로써 흐름을 최적화하기 위해, 또한 서로 이상의 엔드 포인트를 다중화하는 것이 가능하다. 이 상황에 맞는 DNA 손상과 스트레스의 예를 들어 키나제 다른 C에서 방출 형광 색소로 간단하게이 차 항체를 사용하여 함께 조사 할 수있다hannels. 연속 전자동 셀 시드 화합물 희석 투여 및 염색 포함하는 HCS 플랫폼의 개발뿐만 아니라, 새로운 엔드 포인트의 첨가는 또한 상피에 HPHCs 및 다른 유형의 세포에 대한 강력한 프로파일 링 툴로서 HCS 플랫폼의 기능을 확장 할 .
The authors have nothing to disclose.
저자는 원고의 자신의 검토를 위해 Karsta Luettich과 그레고리 Vuillaume에게 감사의 말씀을 전합니다.
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
Screener (HCS) | Genedata | NA | |
CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |