Comprendere il comportamento maligno del cancro richiede la creazione di modelli accurati di come le cellule tumorali interagiscono con i componenti del microambiente tumorale, come i macrofagi. Qui descriviamo due metodi per studiare l'interazione delle cellule di glioblastoma con i macrofagi e le microglia associati al tumore, dove viene valutato l'effetto sull'invasione del glioblastoma.
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Articolo metodologico
Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion
In questo articolo
Sommario
Abstract
Glioblastoma multiforme (grado IV glioma) è un tumore umano molto aggressivo, con una sopravvivenza mediana di 1 anno dopo la diagnosi. Nonostante la maggiore comprensione degli eventi molecolari che danno origine a glioblastomi, questo tipo di tumore rimane ancora molto refrattario al trattamento convenzionale. La resezione chirurgica dei tumori cerebrali di alto grado è raramente completa a causa della natura altamente infiltrante di cellule di glioblastoma. approcci terapeutici che attenuano l'invasione delle cellule di glioblastoma è quindi un'opzione attraente. Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che i macrofagi e microglia tumore (macrofagi cerebrali residenti) fortemente stimolare glioblastoma invasione associati. Il protocollo descritto in questo documento viene utilizzato per modellare glioblastoma-macrofagi / microglia interazione mediante saggi in vitro di cultura. Questo approccio può facilitare notevolmente lo sviluppo e / o la scoperta di farmaci che interrompono la comunicazione con i macrofagi che permette a questo behav malignaior. Abbiamo stabilito due robusti saggi co-coltura di invasione dove microglia / macrofagi stimolano l'invasione delle cellule di glioma da 5 - 10 volte. cellule di glioblastoma marcate con un marcatore fluorescente o esprimono costitutivamente una proteina fluorescente sono placcati senza e con macrofagi / microglia su inserti camera policarbonato matrice rivestite o incorporati in una matrice tridimensionale. invasione cellulare viene valutata mediante microscopia a fluorescenza ad immagine e contare le cellule invasive solo sulla parte inferiore del filtro. L'utilizzo di questi test, diversi inibitori farmacologici (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib, e Semapimod), sono stati identificati che bloccano macrofagi / microglia stimolata glioblastoma invasione.
Introduzione
Glioblastoma multiforme è un cancro aggressivo cervello umano con una sopravvivenza media di circa 12 mesi dal momento della diagnosi 1,2. Glioblastoma è uno dei tumori più letali e clinicamente impegnativi in quanto è refrattario alla chemioterapia standard e la resezione chirurgica. La natura diffusa del glioblastoma permette alle cellule tumorali di diffondersi in tutto il cervello normale rendendo il tumore avanzato praticamente impossibile chirurgicamente resecare completamente. Questo aspetto altamente invasiva è una caratteristica segno distintivo di glioblastoma e altri astrocitomi avanzate. Pertanto, l'attenzione di molte ricerche è stato su....
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Protocollo
1. Etichettatura fluorescente di cellule
Linee cellulari di glioblastoma Label e microglia con coloranti fluorescenti 9: NOTA. In alternativa, generare linee cellulari che esprimono costitutivamente proteine fluorescenti come la GFP / RFP come descritto in 14.
- cellule piastra su una piastra 6 bene tale che essi saranno in 70 - 80% confluenti il giorno della colorazione. Per la linea murino di cellule di glioblastoma GL261 e la linea U87 di cellule di glioblastoma umano, piatto 1 x 10 6 e 1,5 x 10 6 cellule, rispettivamente, su un piatto di 6 centimetri 24 ore prima della colorazione.
- Preparare....
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Risultati
Utilizzando i metodi descritti qui, abbiamo dimostrato che la microglia e macrofagi possono stimolare notevolmente l'invasione delle cellule di glioblastoma. Due diversi saggi di invasione sono impiegati e sono descritte nella Figura 1. Nella figura 2, le cellule GL261 che costitutivamente esprimono la proteina fluorescente mCherry sono stati piastrati su camere prerivestiti con e senza microglia per 48 ore. cellule GL261 erano minimamente invasiva p.......
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Discussione
La natura altamente invasiva di astrocitoma alto grado e glioblastoma rendono questi tumori cerebrali molto mortale. E 'quindi di fondamentale importanza per comprendere i meccanismi molecolari e cellulari di glioblastoma invasione. Molto è stato imparato a conoscere il processo di glioblastoma invasione già 17. Utilizzando i formati di test descritti in questo documento, il nostro laboratorio ha dimostrato sia in mouse e modelli umani che di tumore associato macrofagi possono stimolare l'invasione de.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Konstantin Dobrenis per aver fornito la microglia murina per questi studi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Camera di invasione Corning BioCoat Matrigel: Con matrice BD Matrigel | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Terreni privi di siero di macrofagi (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Sonde molecolari | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Sonde molecolari | C2925 | |
| Linea cellulare GL261 | National Cancer Institute (NCI) | ||
| Linea cellulare U87 | Collezione di colture per tipi di tessuto americani | HTB-14 | |
| Linea cellulare THP-1 | Collezione di colture per tipi di tessuto americani | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Soluzione di formaldeide | Sigma Inserti | F1635 | |
| Corning Transwell (8 & micro; M pore) 48 per confezione. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex Matrice di coltura 3D Fattore di crescita ridotto Estratto di membrana basale, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Siero fetale di vitello (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Siero bovino Albumina, frazione V, trattato con shock termico | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0,5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
Riferimenti
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland,....
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Ristampe e permessi
