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Articolo metodologico

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

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DOI:

10.3791/53990

⸱

20 ottobre 2016

 ,  ,  , 
1New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University, 2Department of Physiology and Medical Physics, Royal College of Surgeons in Ireland, 3The Feinstein Institute for Medical Research at North Shore-LIJ, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Comprendere il comportamento maligno del cancro richiede la creazione di modelli accurati di come le cellule tumorali interagiscono con i componenti del microambiente tumorale, come i macrofagi. Qui descriviamo due metodi per studiare l'interazione delle cellule di glioblastoma con i macrofagi e le microglia associati al tumore, dove viene valutato l'effetto sull'invasione del glioblastoma.

Abstract

Glioblastoma multiforme (grado IV glioma) è un tumore umano molto aggressivo, con una sopravvivenza mediana di 1 anno dopo la diagnosi. Nonostante la maggiore comprensione degli eventi molecolari che danno origine a glioblastomi, questo tipo di tumore rimane ancora molto refrattario al trattamento convenzionale. La resezione chirurgica dei tumori cerebrali di alto grado è raramente completa a causa della natura altamente infiltrante di cellule di glioblastoma. approcci terapeutici che attenuano l'invasione delle cellule di glioblastoma è quindi un'opzione attraente. Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che i macrofagi e microglia tumore (macrofagi cerebrali residenti) fortemente stimolare glioblastoma invasione associati. Il protocollo descritto in questo documento viene utilizzato per modellare glioblastoma-macrofagi / microglia interazione mediante saggi in vitro di cultura. Questo approccio può facilitare notevolmente lo sviluppo e / o la scoperta di farmaci che interrompono la comunicazione con i macrofagi che permette a questo behav malignaior. Abbiamo stabilito due robusti saggi co-coltura di invasione dove microglia / macrofagi stimolano l'invasione delle cellule di glioma da 5 - 10 volte. cellule di glioblastoma marcate con un marcatore fluorescente o esprimono costitutivamente una proteina fluorescente sono placcati senza e con macrofagi / microglia su inserti camera policarbonato matrice rivestite o incorporati in una matrice tridimensionale. invasione cellulare viene valutata mediante microscopia a fluorescenza ad immagine e contare le cellule invasive solo sulla parte inferiore del filtro. L'utilizzo di questi test, diversi inibitori farmacologici (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib, e Semapimod), sono stati identificati che bloccano macrofagi / microglia stimolata glioblastoma invasione.

Introduzione

Glioblastoma multiforme è un cancro aggressivo cervello umano con una sopravvivenza media di circa 12 mesi dal momento della diagnosi 1,2. Glioblastoma è uno dei tumori più letali e clinicamente impegnativi in ​​quanto è refrattario alla chemioterapia standard e la resezione chirurgica. La natura diffusa del glioblastoma permette alle cellule tumorali di diffondersi in tutto il cervello normale rendendo il tumore avanzato praticamente impossibile chirurgicamente resecare completamente. Questo aspetto altamente invasiva è una caratteristica segno distintivo di glioblastoma e altri astrocitomi avanzate. Pertanto, l'attenzione di molte ricerche è stato sul meccanismo molecolare di invasione delle cellule di glioblastoma. Il microambiente tumorale glioblastoma gioca un ruolo fondamentale nella creazione di malignità 3-6. Tumore associato macrofagi / microglia hanno dimostrato di essere responsabile della promozione di glioblastoma invasione 7,8. La maggior parte di questi studi tuttavia misurato l'effetto di macrofagi / microglia usandosaggi che fisicamente li separano dalle cellule di glioblastoma. Il nostro laboratorio ha stabilito per generare saggi miglioramento che ci permettono di studiare come glioblastoma invasione dipende macrofagi / microglia in co-colture e ci consentono di immagine l'interazione fisica tra di loro durante l'invasione.

saggi classici per misurare l'invasione delle cellule includono i chemiotassi camera di Boyden "standard" e formati chemioinvasione. Qui le cellule da studiare sono placcati in una camera di plastica che contiene un filtro di policarbonato sul fondo che ha pori di una dimensione specificata (in genere tra 0,4 e 8 micron di diametro). Il processo di invasione delle cellule comporta una barriera fisica, generalmente composto da proteine ​​della matrice extracellulare. Nel saggio chemioinvasione, la matrice preferito utilizzato è Matrigel (di seguito denominato "matrice"), una miscela di proteine ​​della matrice extracellulare secreta dalle Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del mouse sarcoma ed è costituito in gran parte di collagen tipo IV e laminina. Le camere vengono poi poste in un pozzo di coltura tissutale, che contiene mezzi di coltura cellulare, con o senza fattori di crescita che sono sospettati di stimolare l'invasione. Le cellule che hanno una maggiore capacità invasiva invaderanno attraverso il filtro rivestito matrice extracellulare ad una frequenza superiore e aderire alla parte inferiore del filtro. Abbiamo modificato questo test al fine di valutare il ruolo della microglia e macrofagi tumore associati su invasione delle cellule di glioblastoma.

Siamo stati in grado di determinare con saggi co-coltura descritti in questo documento che la microglia possono stimolare l'invasione di due linee cellulari di glioblastoma da 5 - 10 volte 9,10. Questo riflette ciò che viene osservato in modelli animali di glioblastoma. Inoltre, abbiamo sviluppato un saggio a tre invasione tridimensionale in cui le interazioni tra cellule di glioblastoma e macrofagi / microglia possono essere esaminate in modo più diretto. L'entità della invasione delle cellule di glioblastoma stimolato da macrophaGes / microglia nel dosaggio 3D è paragonabile a quello che si vede usando l'approccio camera di matrice rivestita. Test simili sono stati precedentemente sviluppato per studiare le interazioni di carcinoma della mammella con macrofagi durante l'invasione 11-13. Entrambi i metodi descritti in questo documento dovrebbe aiutare nella capacità di sezionare il meccanismo molecolare (s) di macrofagi / microglia stimolata invasione delle cellule di glioblastoma.

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Protocollo

1. Etichettatura fluorescente di cellule

Linee cellulari di glioblastoma Label e microglia con coloranti fluorescenti 9: NOTA. In alternativa, generare linee cellulari che esprimono costitutivamente proteine fluorescenti come la GFP / RFP come descritto in 14.

  1. cellule piastra su una piastra 6 bene tale che essi saranno in 70 - 80% confluenti il ​​giorno della colorazione. Per la linea murino di cellule di glioblastoma GL261 e la linea U87 di cellule di glioblastoma umano, piatto 1 x 10 6 e 1,5 x 10 6 cellule, rispettivamente, su un piatto di 6 centimetri 24 ore prima della colorazione.
  2. Preparare la soluzione colorante fluorescente macchia cellule in DMSO e aggiungere colorante 5 micron a mezzi di comunicazione, sia di medie Roswell Park Memorial Institute (RPMI) o macrofagi siero libero Medium (MSFM), vortex bene.
  3. Incubare le cellule con la tintura per 30 minuti a 37 ° C e 5% CO 2.
  4. Rimuovere colorante supporti contenenti e aggiungere mezzi freschi (RPMI o MSFM) alle cellule.
  5. Incubare le cellule per 30 min. Nota: Le cellule sono oramacchiata e pronto per essere utilizzato nell'esperimento.

2. Pre-rivestito Assay Matrix Camera coculture Invasion

  1. Differenziare le cellule THP-1 usando acetato forbolo miristato (PMA) 15.
    1. Tavola 2 - 3 x 10 5 THP-1 le cellule in 1,5 ml di RPMI / 10% FBS in una piastra di coltura 6 bene. Subito dopo la placcatura aggiungere 100 nM PMA e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
      NOTA: Dopo 48 ore, cellule THP-1 che hanno superato differenziazione saranno aderente e diffuso al fondo del pozzo assumere una morfologia rotonda.
    2. Rimuovere PMA lavando una volta con PBS 1x e sostituirlo con fresco RPMI / 10% FBS. Aspetta un altro 48 ore fino a quando le cellule sono pronte per l'uso in test.
  2. Equilibrare matrice camere di pre-rivestiti mettendoli in un pozzetto contenente 500 ml di mezzi da solo (senza siero) e l'aggiunta di 500 ml di mezzi da solo verso l'alto. Incubare camere per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
    Nota: camere di pre-rivestiti sono stati acquistati dal produttore; vedi Tabella dei materiali / attrezzature.
  3. Per staccare delicatamente le cellule (linee di cellule di glioblastoma fluorescente e le microglia / macrofagi), rimuovere i supporti dalle cellule mediante aspirazione. Lavare le cellule sul piatto con 2 mM EDTA / PBS. Aggiungere 500 ml di 2 mM EDTA / PBS e incubare per 5 - 10 min in un incubatore cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
  4. Risospendere le cellule in 5 ml di supporti contenenti 0,3% di sieroalbumina bovina (BSA).
  5. Centrifugare per 5 min a 120 x g.
  6. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in mezzi BSA MSFM / 0,3% (per celle GL261 e microglia) o RPMI / 0.3% BSA (per U87 e cellule THP-1) tale che la concentrazione di cellule è pari a 1 x 10 6 cellule / ml . Utilizzare un emocitometro per contare le cellule.
  7. Aggiungere 500 microlitri media / 0.3% BSA per pozzetto di 24 pozzetti.
  8. Rimuovere i supporti dalle camere che sono state equilibrate per almeno 2 ore (fase 2.2). luogo Chambers in pozzetto contenente 500 microlitri media / 0,3% di BSA (passo 2,7).
  9. Se inibitori vengono utilizzati per studiare il loro effetto sulla macrofagi / microglia stimolati glioma invasione, aggiungere la concentrazione appropriata sia inferiore e superiore porzioni della camera.
    NOTA: Le concentrazioni di CSF-1R inibitore utilizzato per inibire completamente microglia stimolata GL261 glioblastoma invasione può essere trovato in riferimento 9.
  10. A seconda delle linee cellulari, aggiungere le cellule nella camera superiore come descritto nei due passaggi successivi: glioblastoma mouse (2.10.1) e glioblastoma umano (2.10.2).
    1. Mescolare 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) cellule (150 ml) e 5 x 10 4 microglia mouse (50 ml) (vedere il punto 2.6 per i dettagli dei media). Portare il volume a 500 ml con l'aggiunta di 300 ml MSFM / 0,3% di BSA. Aggiungere miscela di cellule nella camera superiore e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
      NOTA: microglia murino sono isolati da topi neonati come ho descritton 1 6.

Mescolare 7.5 x 10 4 U87 (glioblastoma) cellule (75 ml) e 2,5 x 10 4 THP1 (macrofagi) cellule (25 ml). Portare il volume a 500 ml con l'aggiunta di 400 ml RPMI / 0,3% di BSA. Aggiungere la miscela di cellule nella camera superiore. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore.

  1. Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dalla parte superiore della camera di aspirando delicatamente e fissare camere mettendo in 3,7% di formaldeide in PBS. Consentire camere di rimanere in fissativo per 15 minuti a temperatura ambiente (o per una notte a 4 ° C). Rimuovere fissativo delicatamente aspirazione e sostituire con 500 microlitri PBS 1X. Procedere alla sezione 4 per l'analisi delle immagini.
    NOTA: esperimento può essere messo in pausa in questo momento e salvato per l'imaging in 1x PBS. segnali colorante fluorescente possono essere rilevati fino a 2 settimane dopo la fissazione.

3. Invasione Assay "3D" -embedding glioma e macrofagi / microglia a Matrix

  1. mix di matrice Scongelare a 4 ° C durante la notte. Eseguire tutte le ulteriori manipolazioni che impiegano una matrice sul ghiaccio nel cappuccio.
  2. Preparare 10 mg / ml concentrazione di matrice nei media (MSFM o RPMI) con 0,3% BSA in ghiaccio.
    NOTA: Archivio concentrazione della matrice è tipicamente circa 15 mg / ml.
  3. Per preparare le celle (etichettate al punto 1) per la sospensione di Matrix, rimuovere i supporti dalle cellule mediante aspirazione. Lavare le cellule sul piatto con 2 mM EDTA / PBS. Aggiungere 500 ml di 2 mM EDTA / PBS alle cellule e incubare per 5 - 10 min in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
  4. Risospendere le cellule in 5 ml di supporti contenenti 0,3% di BSA.
  5. Centrifugare per 5 min a 120 x g.
  6. Aspirare il surnatante dai pellet. Risospendere pellet in media / 0.3% BSA tale che la concentrazione di cellule è uguale a 1 x 10 6 cellule / ml. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule.
  7. Aggiungere 1,5 x 10 5 cellule GL261 (in 150 ml) + 5 x 10 4 cellule microgliali (in 50 ml) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.Aggiungere 2 x 10 5 cellule GL261 (200 ml) in un tubo separato da microcentrifuga 1,5 ml.
    NOTA: le cellule GL261 da solo senza microglia serve come controllo.
  8. celle Spin in microcentrifuga per 5 min a 120 x g.
  9. Risospendere le cellule in 200 ml di matrice fredda su ghiaccio.
  10. Piatto 50 microlitri (50.000 cellule) sul centro del vano superiore dell'inserto camera di dimensione dei pori 8 mM.
  11. Incubare a 37 ° C per 30 minuti per la polimerizzazione a verificarsi.
  12. Aggiungere 200 microlitri mezzo privo di siero per la camera superiore e 700 microlitri di siero contenente terreno di crescita cellulare ai minori bene.
  13. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
  14. Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dalla parte superiore della camera di aspirando delicatamente e fissare camere mettendo in 3,7% di formaldeide in PBS. Consentire camere di rimanere in fissativo per 15 minuti a temperatura ambiente (o per una notte a 4 ° C). Rimuovere fissativo delicatamente aspirazione e sostituire con 500 microlitri PBS 1X. Procedere alla sezione 4 FOanalisi delle immagini r.

4. Saggi di imaging

  1. Rimuovere camere da 3,7% di formaldeide e lavare in ben contenente fresco 500 microlitri PBS 1x.
    NOTA: Non lasciare le camere si asciughino.
  2. Usando un applicatore con punta di cotone, pulire delicatamente le cellule non invasive dalla porzione superiore del filtro (lato rivolto verso l'interno della camera) raschiando la superficie del filtro. Inizia con delicatezza e aumentare gradualmente la pressione. Fate questo almeno 3 volte per ogni camera.
  3. Mettere camere sia in un piatto fondo di vetro o di lasciare in un piatto ben 24.
  4. Collocare il campione sul palcoscenico di un epifluorescente o laser confocale microscopio a fluorescenza dotato di telecamera e l'acquisizione di immagini software di 9,10.
  5. Prendere diversi 10X o 20X immagini di campi rappresentative.
  6. Utilizzando un software di analisi delle immagini, come ad esempio ImageJ, contare il numero di cellule di glioblastoma che hanno attraversato il filtro alla parte inferiore 9,10.
  7. Se l'imaging del "3D. "Saggio di invasione (descritto nella sezione 3), generare una serie Z pila utilizzando un laser a fluorescenza confocale 5-6 Per un'immagine popolazione cellulare invasivo sul lato inferiore del filtro, seguire il protocollo passi 4.2 - 4.6 sopra descritto.

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Risultati

Utilizzando i metodi descritti qui, abbiamo dimostrato che la microglia e macrofagi possono stimolare notevolmente l'invasione delle cellule di glioblastoma. Due diversi saggi di invasione sono impiegati e sono descritte nella Figura 1. Nella figura 2, le cellule GL261 che costitutivamente esprimono la proteina fluorescente mCherry sono stati piastrati su camere prerivestiti con e senza microglia per 48 ore. cellule GL261 erano minimamente invasiva p...

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Discussione

La natura altamente invasiva di astrocitoma alto grado e glioblastoma rendono questi tumori cerebrali molto mortale. E 'quindi di fondamentale importanza per comprendere i meccanismi molecolari e cellulari di glioblastoma invasione. Molto è stato imparato a conoscere il processo di glioblastoma invasione già 17. Utilizzando i formati di test descritti in questo documento, il nostro laboratorio ha dimostrato sia in mouse e modelli umani che di tumore associato macrofagi possono stimolare l'invasione de...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Dr. Konstantin Dobrenis per aver fornito la microglia murina per questi studi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Camera di invasione Corning BioCoat Matrigel: Con matrice BD MatrigelCorning/Fisher ScientificCat: 354481
Terreni privi di siero di macrofagi (MSFM) (500 ml)Life Technologies12065-074
CellTracker Red CMTPX DyeLife Technologies/Sonde molecolariC34552
CellTracker Green CMFDA DyeLife Technologies/Sonde molecolariC2925
Linea cellulare GL261National Cancer Institute (NCI)
Linea cellulare U87Collezione di colture per tipi di tessuto americaniHTB-14
Linea cellulare THP-1Collezione di colture per tipi di tessuto americaniATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml)Life Technologies/Gibco11875-093
Soluzione di formaldeideSigma InsertiF1635
Corning Transwell (8 & micro; M pore) 48 per confezione.CorningCLS3422
Cultrex Matrice di coltura 3D Fattore di crescita ridotto Estratto di membrana basale, PathClearTrevigen3445-005-01
Siero fetale di vitello (FBS)Life TechnologiesCat: 10500064
Siero bovino Albumina, frazione V, trattato con shock termicoFisherscientificBP1600-100
0,5 M EDTAThermoFisher Scientific15575-020
forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma AldrichP8139-1MG
per colture cellulari con membrana in policarbonato Corning

Riferimenti

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