In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Ho Lam Tang; Ho Man Tang; Ming Chiu Fung; J. Marie Hardwick

doi:10.3791/53992

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Articolo metodologico

In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

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DOI:

10.3791/53992

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27 novembre 2016

Ho Lam Tang¹ , Ho Man Tang¹ , Ming Chiu Fung² , J. Marie Hardwick¹

¹W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, ²School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

In questo articolo

Sommario

Per rilevare le cellule sane in animali interi che contengono bassi livelli di attività delle caspasi, il biosensore altamente sensibile designato CaspaseTracker è stato generato per Drosophila. attività biosensore caspasi-dipendente viene rilevato in cellule sane lunga durata durante gli organi interni di animali adulti allevati in condizioni ottimizzate in assenza di stimoli morte.

Abstract

Le caspasi sono i mediatori chiave della morte cellulare apoptotica attraverso la loro attività proteolitica. Quando le caspasi vengono attivate nelle cellule a livelli rilevabili dalle tecnologie disponibili, si presume generalmente che l'apoptosi si verifichi poco dopo. Le caspasi possono scindere molti componenti funzionali e strutturali per causare una rapida e completa distruzione cellulare in pochi minuti. Tuttavia, l'accumulo di prove indica che nelle cellule sane normali le stesse caspasi hanno altre funzioni, presumibilmente a livelli enzimatici più bassi. Gli studi sull'attività delle caspasi non apoptotiche sono stati ostacolati dalle difficoltà di rilevare bassi livelli di attività delle caspasi e di tracciare il destino cellulare finale in vivo. Qui, illustriamo l'uso di un reporter di caspasi ultrasensibile, CaspaseTracker, che etichetta in modo permanente le cellule che hanno sperimentato l'attività della caspasi in animali interi. Questo biosensore CaspaseTracker in vivo a due colori per Drosophila melanogaster esprime transitoriamente la proteina fluorescente rossa (RFP) per indicare l'attività della caspasi recente o in corso ed esprime in modo permanente la proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule che hanno sperimentato l'attività della caspasi in qualsiasi momento in passato ma che non sono morte. È importante sottolineare che questo biosensore in vivo caspasi-dipendente rivela prontamente la presenza di attività caspasica non apoptotica nei tessuti dei sistemi di organi in tutto il moscerino adulto. Ciò è dimostrato utilizzando dissezioni dell'intera montatura di singoli moscerini per rilevare l'attività del biosensore in cellule sane in tutto il cervello, l'intestino, i tubuli malpighiani, il cardias, i dotti ovarici e altri tessuti. CaspaseTracker rileva l'attività delle caspasi non apoptotiche nelle cellule longeve, poiché l'attività dei biosensori viene rilevata nei neuroni adulti e in altri tessuti almeno 10 giorni dopo l'attivazione della caspasi. Questo biosensore funge da strumento importante per scoprire i ruoli e i meccanismi molecolari dell'attività delle caspasi non apoptotiche negli animali vivi.

Introduzione

Caspasi sono proteasi cisteina che mediano la morte cellulare per apoptosi, con l'adesione molte proteine intracellulari dopo residui di aspartato chiave. Ad esempio, caspasi iniziatrici attivano le caspasi effettrici, nucleasi DNA derepress, componenti del citoscheletro Cleave e alterano la composizione lipidica delle membrane cellulari di smantellare rapidamente le cellule e stimolare il loro riconoscimento e engulfment da parte delle cellule che smaltiscono i cadaveri cellula vicina. ^1-4 Si stima che miliardi di cellule muoiono al giorno nel corpo umano, e l'apoptosi è un importante meccanismo di morte delle cellule tumorali indotta da chemiot....