Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.

Abstract

Nel microambiente tumorale, le cellule stromali ospiti interagiscono con le cellule tumorali per promuovere la progressione tumorale, l'angiogenesi, la disseminazione delle cellule tumorali e le metastasi. Le interazioni multicellulari nel microambiente tumorale possono portare a eventi transitori tra cui la motilità direzionale delle cellule tumorali e la permeabilità vascolare. La quantificazione della permeabilità vascolare tumorale ha spesso utilizzato esperimenti end-point per misurare lo stravaso di coloranti vascolari. Tuttavia, a causa della natura transitoria delle interazioni multicellulari e della permeabilità vascolare, la cinetica di questi eventi dinamici non può essere distinta. Marcando le cellule e il sistema vascolare con coloranti iniettabili o proteine fluorescenti, la microscopia intravitale time-lapse ad alta risoluzione ha permesso la visualizzazione diretta e in tempo reale degli eventi transitori nel microambiente tumorale. Qui descriviamo un metodo per utilizzare la microscopia multifotone per eseguire l'imaging intravitale esteso in topi vivi per visualizzare direttamente le dinamiche multicellulari nel microambiente tumorale. Questo metodo descrive in dettaglio le strategie di marcatura cellulare, la preparazione chirurgica di un lembo cutaneo mammario, la somministrazione di coloranti o proteine iniettabili tramite catetere della vena caudale e l'acquisizione di immagini time-lapse. Le sequenze time-lapse ottenute con questa metodica facilitano la visualizzazione e la quantificazione della cinetica degli eventi cellulari di motilità e permeabilità vascolare nel microambiente tumorale.

Introduzione

Diffusione di cellule tumorali dal tumore mammario primario ha dimostrato di coinvolgere non solo le cellule tumorali, ma ospitare cellule stromali compresi macrofagi e cellule endoteliali. Inoltre, il tumore vascolare è anormale con aumento della permeabilità ^1. Così, determinare come le cellule tumorali, macrofagi e cellule endoteliali interagiscono per mediare la permeabilità vascolare e intravasation delle cellule tumorali nel microambiente tumorale primaria è importante per la comprensione delle metastasi. Comprendere la cinetica della permeabilità vascolare, intravasation delle cellule tumorali e il meccanismo di segnalazione alla base delle interazi....

Protocollo

Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui la preventiva approvazione da parte del Albert Einstein College of Medicine Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.

1. Generazione di fluorescenza Tumori etichettati e macrofagi associati al tumore

1. Generare cellule tumorali fluorescente attraversando il, autoctona, topo geneticamente modificato modello cancro mammario spontaneo in cui la ripetizione lungo terminale virus tumore del mouse mammaria spinge l'antigene polioma mezzo T (MMTV-PyMT) con i topi transgenici con i giornalisti fluoresc....

Risultati

Esteso microscopia time-lapse intravitale permette l'imaging singola cella risoluzione dei processi multicellulari nel microambiente tumorale. Da parte delle cellule tumorali fluorescenza etichettatura, i macrofagi, lo spazio vascolare, e visualizzare la rete di fibre di collagene con il secondo segnale di generazione di armoniche, comparti multipli nel microambiente tumorale sono contemporaneamente monitorati durante l'imaging. Le cellule tumorali marcate con proteine ​​fluoresc.......

Discussione

interazioni cellulari che si verificano spontaneamente nel microambiente tumorale possono portare a cambiamenti nella motilità delle cellule tumorali e intravasation. High-Resolution Imaging intravitale del tessuto tumorale dal vivo permette la visualizzazione delle dinamiche pluricellulari che possono essere ^10,13,24 altamente transitorio. End-point in vivo o immagini time-lapse acquisiti con i punti di tempo discreto grado di fornire informazioni essenziali sui meccanismi molecolari dei processi ne.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
155 kDa destron-tetrametilrodamina isotiocianato	Sigma Aldrich	T1287	ricostituito a 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa destrano-Texas Red	Life Technologies	D-1830	ricostituito a 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa destron-fluoresceina isotiocianato	Sigma Aldrich	FD10S	ricostituito a 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Tecnologie	Q21561MP	Diluire 25 μ l in 175 μ l di 1x PBS per iniezione
MMTV-PyMT topi	Jackson Laboratory	2374
Topi Csf1r-ECFP (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Topi Csf1r-EGFP Jackson	Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurano)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
di ossigeno	AirTech
Siringa da 1 ml, punta antitubercolina	BD	309659
30 G x 1 (0,3 mm x 25  mm) ago	BD	305128
Tubo medico micro in polietilene	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0,28 mm D.I. x 0,64 mm O.D.
Vetro di copertura per microscopio	Corning	2980-225	spessore 1,5, 22 x 50  mm
PhysioSuite MouseSTAT pulsossimetro, software e sensori	Nastro da laboratorio Kent
	Fisher Scientific	159015R
cuscinetto in gomma morbida	McMaster-Carr	8514K62	in poliuretano ultramorbido, 3/16" Spesso, 12" x 12", 40 Oo Durometro, cuscinetto in
gomma dura	McMaster-Carr	8568K615	Foglio di gomma neoprene ad alta resistenza 1/4" di spessore, 12" x 12", 50  Un
microscopio	Olympus		Il microscopio è un microscopio multifotone a due laser costruito su misura basato su un supporto Olympus IX-71 che utilizza un obiettivo 20X 1.05NA.
Set di 7 punzoni	McMaster-Carr	3429A12	Diametro foro da 1/4" a 1", per punzone a percussione

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