Articolo metodologico

Stencil micropatterning di cellule staminali umane pluripotenti per Probing spaziale Organizzazione di differenziazione Fates

DOI:

10.3791/54097

⸱

17 giugno 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità intrinseca di differenziare e di auto-organizzarsi in schemi dei tessuti distinti; anche se questo richiede la presentazione di gradienti spaziali ambientali. Presentiamo stencil micropatterning come metodo semplice e robusto per generare gradienti biochimici e meccanici per controllare modelli differenziazione HPSC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), comprese le cellule staminali embrionali e le cellule staminali pluripotenti indotte, hanno la capacità intrinseca di differenziarsi in tutti e tre gli strati germinali. Questo li rende una fonte cellulare attraente per la medicina rigenerativa e la modellazione sperimentale dell'organogenesi normale e malata. Tuttavia, la differenziazione delle hPSC in vitro è eterogenea e spazialmente disordinata. Le tecnologie di micropatterning cellulare offrono potenzialmente i mezzi per controllare spazialmente i microambienti delle cellule staminali e organizzare i destini di differenziazione risultanti. La micromodellazione delle hPSC deve tenere conto dei severi requisiti per la sopravvivenza e il mantenimento delle hPSC. Qui, descriviamo il micropatterning degli stencil come un metodo altamente compatibile con le hPSC. I micropattern hPSC sono specificati dalle geometrie dei fori passanti dello stencil cellulare, che delimitano fisicamente le posizioni in cui le hPSC possono accedere e attaccarsi al substrato sottostante rivestito di matrice extracellulare. Grazie a questa modalità operativa, vi è una maggiore flessibilità nell'utilizzo di substrati in grado di supportare adeguatamente le hPSC rispetto ad altri metodi di micropatterning cellulare. Evidenziamo anche i passaggi critici per il successo della generazione di micropattern hPSC. Ad esempio, dimostriamo che il micropatterning stencil delle hPSC può essere utilizzato per modulare la polarizzazione spaziale delle aderenze cellula-cellula e cellula-matrice, che a sua volta determina i modelli di differenziazione del mesoendoderma. Questo metodo semplice e robusto per micromodellare le hPSC amplia le prospettive di stabilire modelli sperimentali per studiare l'organizzazione e il patterning dei tessuti durante lo sviluppo embrionale precoce.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), comprese le cellule staminali embrionali (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono ampiamente sfruttati in medicina rigenerativa, nonché la modellazione sperimentale di organogenesi normale e malati a causa del loro potenziale di differenziazione in linee cellulari di tutti tre strati germinali 1,2. I destini di differenziazione di hPSCs sono estremamente sensibili ai fattori ambientali locali in grado di modulare i processi meccanotrasduzione autocrini o paracrini segnalazione 1 e mediate da stimoli fisici 3-5. Cellulare micropatterning comprende un insieme di t....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Questo protocollo descrive la fabbricazione di PDMS stencil con 1.000 micron modelli di taglio laser e micropatterning della linea hESC, H9 con lo stencil PDMS.

1. progettazione e fabbricazione di PDMS Stencil per micropatterning

  1. Progettare il foglio di stencil con fori passanti della geometria desiderata e le dimensioni (ad esempio, 1.000 micron cerchi) e la guarnizione stencil utilizzando il computer-aided software di progettazione 10.
  2. Laser-tagliare il foglio di stencil e la guarnizione sul 120-150 micron e 2 mm di spessore polidimetilsilossano (PDMS) fogli rispettivamente con un laser CO ....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo articolo, descriviamo la fabbricazione di uno stencil cella utilizzando una taglierina laser per generare 1.000 micron caratteristiche. La matrice è composta da 2 parti: un sottile foglio stencil (circa 100-200 micron di spessore), contenente la micropattern fori passanti, ed una guarnizione PDMS a contenere la soluzione di rivestimento ECM o sospensione cellulare. Qui, 127 micron e 2 mm di spessore fogli PDMS disponibili in commercio sono stati usati come foglio stencil e la g.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fabbricazione di stencil micropatterning

micropatterning Stencil fornisce un metodo ideale per generare microdisegni HPSC per indagare nicchia mediata differenziazione patterning. Il vantaggio principale di stencil patterning rispetto ad altre tecniche micropatterning, come la stampa microcontact e photopatterning, è che non richiede la modifica della superficie e può essere implementato su supporti TCP convenzionali. Pertanto, terreni di coltura ottimizzati e rives.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è sostenuto da NUS Messa in concessione (R-397-000-192-133) e ETPL Fondo Gap (R-397-000-198-592). GS è uno studioso NUS di ricerca. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jiangwa Xing per il suo supporto tecnico micropatterning cellulare.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
  2 millimetri di spessore foglio PDMSSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.005Utilizzato per formare il serbatoio per lo stencil
120-150 μ m foglio di PDMS spessoSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.040Utilizzato per formare stencil 
Piastra di Petri da 60 mmNunc Nunclon Delta150326Substrato per micropatterning
AccutaseAccutase, Merck Millipore, SingaporeSCR005Enzima per rompere le cellule H9 in singole cellule
Activina   R& D Systems, Singapore338-AC-010Fattore di crescita per la differenziazione H9
BMP4 R& D Systems, Singapore338-BP-010Fattore di crescita per il sistema al plasma di differenziazione H9
 Femto Science, CoreaCUTE-MPPer l'ossidazione al plasma dello stencil
DispaseStemCell&; Technologies, Singapore7923Enzima utilizzato per indebolire l'adesione cellula-ECM durante il passaggio
DMEM/F12GIBCO, USA11330032Terreno basale per cellule
H9 FGF2R& D Systems, Singapore233– FB– 025Fattore di crescita per la differenziazione H9
Linea cellulare H9WiCell Research Institute, Inc., USAWA09Cellule staminali embrionali umane
Matrice di membrana basale qualificata hESCMatrigel, BD Biosciences, Singapore354277Rivestimento di matrice extracellulare per supportare la crescita di cellule H9
Microscopio invertitoLeica Microsystems, SingaporeDMi1Per catturare il campo chiaro immagini
Taglio laserEpilog Helix 24 SistemaUtilizzato per generare fori passanti in fogli PDMS
mTeSR™ 1 medio Cellule staminali&commercio; Tecnologie, Singapore5850Mezzo di manutenzione per celle H9
PDMS SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA3097358-1004Utilizzato per attaccare lo stencil PDMS e il reservior
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapore688000Mantiene le cellule H9 come singole cellule 
STEMdiff&commercio; APEL&commercio; medio Cellule staminali&commercio; Technologies, Singapore5210Terreno di differenziazione per celle H9
Film di polietilene tereftalatoSureMark SingaporeSQ-6633Utilizzato per formare stencil 
Tensioattivo non ionico compatibile con colture cellulariAcido pluronico F-127, Sigma, SingaporeP2443Reagente passivante per respingere l'adesione cellulare in substrati non micromodellati
laser

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
  2. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Adesione cellularedifferenziamento del mesoendodermastencil in PDMSmatrice della membrana basalesemina cellulareanalisi microscopica

Articoli correlati