Articolo metodologico

Completamente dispositivo automatizzato centrifuga Microfluidic per il rilevamento di proteine ​​Ultrasensitive da sangue intero

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DOI:

10.3791/54143

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16 aprile 2016

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1Department of Biomedical Engineering, School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), UNIST-gil 50, Ulsan, Republic of Korea, 2Agency for Defense Development (ADD), Daejeon, Republic of Korea, 3KOGAS (Korea Gas Corporation) Research Institute, 4Center for Soft and Living Matter, Institute for Basic Science (IBS)

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra come raggiungere la sensibilità di rilevamento femtomolare delle proteine in 10 μL di sangue intero entro 30 minuti. Ciò può essere ottenuto utilizzando tappetini nanofibrosi elettrofilati integrati in un lab-on-a-disc, che offre un'elevata superficie e un'efficace miscelazione e lavaggio per un migliore rapporto segnale/rumore.

Abstract

Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è un metodo promettente per rilevare piccole quantità di proteine in campioni biologici. I dispositivi che forniscono una piattaforma per ridurre il volume del campione e il tempo di analisi, nonché l'automazione completa, sono necessari per il potenziale utilizzo nella diagnostica point-of-care. Recentemente, abbiamo dimostrato la rilevazione ultrasensibile delle proteine sieriche, della proteina C-reattiva (CRP) e della troponina cardiaca I (cTnI), utilizzando un lab-on-a-disc composto da tappetini nanofibrosi (NF) di TiO2. Ha mostrato un'ampia gamma dinamica con sensibilità di rilevamento femtomolare (fM), da un piccolo volume di sangue intero in 30 minuti. Il dispositivo è costituito da diversi componenti per la separazione, il dosaggio, la miscelazione e il lavaggio del sangue che sono automatizzati per una migliore sensibilità da bassi volumi di campione. Qui, nel video dimostrativo, mostriamo i protocolli sperimentali e il know-how per la fabbricazione di NF e del disco, la loro integrazione e il funzionamento nel seguente ordine: processi per la preparazione del tappetino TiO2 NF; stampa transfer del tappetino TiO2 NF sul disco; modifica della superficie per reazioni immunitarie, assemblaggio e funzionamento del disco; Rilevamento su disco e risultati rappresentativi per il test immunologico. L'uso di questo dispositivo consente l'analisi multiplex con un consumo minimo di campioni e reagenti. Dati i vantaggi, il dispositivo dovrebbe trovare impiego in un'ampia varietà di applicazioni e dimostrarsi utile nel facilitare l'analisi di proteine poco abbondanti.

Introduzione

Diverse piattaforme per la diagnosi della malattia sono stati sviluppati sulla base di materiali su scala nanometrica 1,2, come nanofili, 3 nanoparticelle, nanotubi 4, 5 e nanofibre (NFS) 6-8. Questi nanomateriali offrono ottime prospettive nella progettazione di nuove tecnologie per saggi biologici altamente sensibili per le loro proprietà fisico-chimiche uniche. Ad esempio, mesoporosa zinco nanofibre ossido sono stati utilizzati per la rivelazione sensibile femto-molare di biomarcatori cancro al seno. 9 Recentemente, nanomateriali a base di biossido di titanio (TiO 2) sono stati esplorati per applicazioni bioanalitici 10 considerando la loro stabilità chimica, 11 denaturazione proteica trascurabile , 12 e biocompatibilità. 13 Inoltre, i gruppi idrossilici sulla superficie di TiO 2 facilitare modificazione chimica e l'attacco covalente di biomolecole. 14,15 modellato TiO 2 thin film 16 o TiO 2 nanotubi 17 sono stati utilizzati per migliorare la sensibilità di rilevazione di una proteina bersaglio, aumentando l'area superficiale; Tuttavia, il processo di fabbricazione è piuttosto complessa e richiede attrezzature costose. D'altra parte, NFS elettrofilate stanno ricevendo attenzione a causa della loro elevata area superficiale, così come processo semplice e di fabbricazione a basso costo; 18,19 ancora, la caratteristica fragile o allentato del NF mat elettrofilate TiO 2 rende difficile da gestire e integrazione con dispositivi microfluidici. 6,20 Pertanto, le TiO2 tappetini NF sono stati raramente utilizzati in applicazioni bioanalitiche, in particolare quelle che richiedono condizioni di lavaggio difficili.

In questo studio, per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia per il trasferimento del elettrofilate NF stuoie sulla superficie di un substrato bersaglio utilizzando uno strato adesivo polidimetilsilossano sottile (PDMS). Furthermore, abbiamo dimostrato con successo l'integrazione di elettrofilate TiO 2 NF stuoie su un dispositivo microfluidico centrifuga in policarbonato (PC). Utilizzando questo dispositivo, una rivelazione sensibile alto, completamente automatizzato e integrato di proteina C-reattiva (CRP) e troponina I cardiaca (cTnI) è stata raggiunta entro 30 minuti da solo 10 ml di sangue intero. 21 A causa della combinata vantaggi delle proprietà della FN e la piattaforma centrifuga, il saggio esposti un'ampia gamma dinamica di sei ordini di grandezza da 1 pg / ml (~ 8 fM) a 100 ng / ml (~ 0,8 pm) con un limite inferiore di rilevamento di 0,8 pg / ml (~ 6 fM) per CRP e una gamma dinamica di 10 pg / ml (~ 0,4 pM) a 100 ng / ml (~ 4 nM) con un limite di rilevazione di 37 pg / ml (~ 1,5 pM) per cTnI. Questi limiti di rilevabilità sono ~ 300 ~ e 20 volte inferiore rispetto ai loro corrispondenti risultati convenzionali ELISA. Questa tecnica può essere applicata per la rilevazione di eventuali proteine ​​bersaglio, con anticorpi appropriati. Nel complesso, questo dispositivo could contribuiscono notevolmente alla diagnostica in vitro e saggi biochimici poiché può rilevare rare quantità di proteine ​​bersaglio con grande sensibilità anche da piccole quantità di campioni biologici; ad esempio, 10 ml di sangue intero. Sebbene abbiamo dimostrato solo la rilevazione di proteine ​​del siero utilizzando ELISA in questo studio, la tecnologia di trasferimento e l'integrazione dei elettrofilate NFs con dispositivi microfluidici potrebbe essere più ampiamente applicato in altre reazioni biochimiche che richiedono una grande superficie per alta sensibilità di rilevazione.

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Protocollo

NOTA: Il sangue è stato prelevato da individui sani ed è stato raccolto in un tubo di raccolta del sangue. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i volontari.

1. Realizzazione di TiO2 NF Mat

  1. Preparazione della soluzione di precursore 22
    1. Sciogliere 1.5 g di titanio tetraisopropoxide (TTIP) in una miscela di etanolo (99,9%, 3 ml) e acido acetico glaciale (3 ml) e miscelare la soluzione a temperatura ambiente (25 ° C) per 30 minuti su un agitatore magnetico.
    2. Sciogliere 11% in peso di polivinil pirrolidone (PVP) in 3,64 g di etanolo (99,9%) e agitare la soluzione a 65 ° C per 1 ora con un agitatore magnetico a piastra calda.
    3. Combinare e mescolare le due soluzioni a 65 ° C per 4 ore su un agitatore magnetico a piastra calda.
  2. electrospinning
    1. Caricare la soluzione preparata in una siringa collegata ad un ago di acciaio inox da 200 micron diame internoter. Versare la soluzione direttamente nella siringa dopo aver rimosso lo stantuffo.
    2. Introdurre la soluzione costantemente ad una velocità di flusso di 0,3 ml / h per 10 min su un Si fetta (2 cm x 2 cm) posto su un substrato a massa ad una tensione continua elevata (15 kV). Durante l'elettrofilatura, impostare la distanza tra l'ago e il substrato a massa a 10 cm.
  3. Calcinazione del tappeto NF
    1. Posizionare il tappetino NF in un forno e aumentare la temperatura fino a 500 ° C con una velocità di rampa di 3 ° C / min in condizioni di alto vuoto (5 x 10 -5 torr).
    2. Mantenere la temperatura a 500 ° C per 3 ore. Raffreddare la temperatura dei campioni alla RT (25 ° C) nel forno.

2. Integrazione del TiO2 NF Mat in un Microfluidic disco centrifugo

  1. Realizzazione di un disco
    1. Utilizzare il software di progettazione 3D (ad esempio, SolIDWorks o simile) per raffigurano camere, canali o valvole di ogni strato di disco. Convertire i file di progettazione di codice a controllo numerico computerizzato (CNC) utilizzando il codice che genera il software (ad esempio, Edgecam o simili). Utilizzare i software in base al manuale di istruzioni 23,24. Nota: Le dimensioni del canale tipici usati in questo dispositivo sono 1,0 millimetri x 0.3 mm (larghezza x profondità).
    2. Aprire il software di funzionamento della fresatrice CNC (ad es., DeskCNC o simili) e caricare il codice CNC al software operativo e selezionare la seguente nell'ordine: "AUTO" -> "G codice aperto" -> Selezionare il codice CNC generato.
    3. Fissare la piastra PC sulla fresatrice CNC: utilizzare 1 piastre mm PC per lo strato superiore e piastre PC 5 mm per lo strato del disco. Eseguire la fresatrice CNC per tagliare ogni strato del disco facendo clic sul pulsante "Start".
  2. Trasferimento di TiO2 NF tappetino sul disco
    1. Inserire un substrato di silicio e una piccola capsula di Petri contenenti 40 ml di (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorosilano in una camera a vuoto sotto vuoto per 30 min. Il fluorosilane vaporizza e viene rivestita sul substrato.
    2. Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) pre-polimero con un agente indurente in un rapporto di 10: 1 e degasare in una camera a vuoto. Spin-coat PDMS su un substrato di silicio a 650 rpm per 60 sec.
    3. Curare il PDMS stesi su substrato di silicio in stufa a 65 ° C per 10 minuti per ottenere uno stato aderente.
      NOTA: Tempo di polimerizzazione può essere variata a seconda delle condizioni ambientali, e la forza di adesione può essere una prova di virata utilizzando un reometro.
    4. Trasferire il tappetino TiO2 NF preparato da electrospinning e calcinazione sul silicio PDMS-rivestite utilizzando una pinzetta. Quindi, applicare manualmente una pressione conforme sul TiO2 NF tappeto trasferito con un oggetto piatto (ad es., Vetrino) e rimuovere l'oggetto. Metterequesto campione in forno a 65 ° C per 4 ore oppure a 80 ° C per 1 ora per curare completamente lo strato PDMS.
    5. Coat camere di reazione vincolanti il disco con 20 microlitri del / indurimento miscela agente PDMS (10: 1), che agisce come uno strato adesivo per fissare TiO 2 NF stuoia sul disco.
    6. Versare 50 ml di etanolo (99,9%) del TiO 2 NF mat sullo strato PDMS, tagliare il tappetino NF con una foratura di diametro di 6 mm, e trasferire il taglio TiO 2 NF tappetino per camere di reazione di legame rivestite con 20 microlitri dei PDMS nel passaggio precedente.
      NOTA: In questo passaggio, etanolo sarà utile per scollegare il NF stuoia taglio TiO 2 dal substrato di Si.
    7. Incubare la NF stuoia disco integrato TiO 2 in forno a 65 ° C per 4 ore oppure a 80 ° C per 1 ora per curare completamente il PDMS.
  3. Modifica della superficie del TiO 2 NF mat sul disco
    1. Prepare 1% v / v soluzione di (3-glicidossipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) in etanolo (99,9%).
    2. Trattare il disco integrato TiO2 NF tappeto con plasma di ossigeno a 140 W, il flusso di ossigeno 50 sccm per 180 sec. Dispensare 100 ml di soluzione di GPDES su ogni tappeto nanofibre e incubare a RT (25 ° C) per 2 ore.
    3. Lavare il substrati brevemente dispensando etanolo (99,9%) con una bottiglia di lavaggio, quindi rimuovere l'etanolo completamente invertendo il disco e assorbente contro un panno pulito. Polimerizzare a 80 ° C per 1 ora. Lavare due volte con etanolo (99,9%) nello stesso modo come sopra, per rimuovere le fisicamente adsorbite e non legati molecole GPDES.
    4. Asciugare con un flusso di azoto, a secco sotto vuoto.
      NOTA: Il disco può essere conservato in un contenitore sigillato a RT (25 ° C) fino al momento dell'uso.
  4. Immobilizzazione di anticorpi sulla superficie
    1. Fare una soluzione di 200 mg / ml di anticorpi di cattura (monoclonale anti topohsCRP umana o monoclonale di topo anti-cTnI) diluendo gli anticorpi con tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Dispensare 5 ml di soluzione su ogni tappeto NF in un disco utilizzando una micropipetta. Vedi l'elenco dei materiali per ulteriori informazioni sui anticorpi.
    2. Conservare i dischi in una camera umidificata e incubare a 37 ° C per 4 ore. Lavare gli anticorpi rivestiti NF tappeto con lo 0,1% tampone BSA-PBS. Riempire la camera con 100 ml di tampone di lavaggio utilizzando una micropipetta, rimuovere il buffer aspirando o decantazione. Infine, capovolgere il disco e asciugare contro un panno pulito, e poi montare il disco.
  5. gruppo disco
    1. Disegnare il disegno del disco su nastro biadesivo utilizzando un programma CAD (ad esempio, AutoCAD o simili). Caricare il disegno CAD al plotter da taglio.
    2. Tagliare il nastro biadesivo con il plotter da taglio. Stacchi un strato di protezione di doppio nastro adesivo e fissare it sulla parte superiore dello strato disco. Staccare l'altro strato di protezione e fissare lo strato superiore sullo strato disco.
    3. Caricare il disco preliminarmente riuniti nella pressa e allineare con precisione i livelli superiore / adesivi / disco utilizzando segni di allineamento in ogni strato per collegare ciascuna valvola, canale, e le camere. Applicare una pressione conforme utilizzare la macchina di pressatura.

3. Immunoassay

  1. Riempire le camere con 1% tampone BSA-PBS utilizzando una micropipetta e incubare il disco a 37 ° C per 1 ora. Rimuovere il buffer mediante aspirazione utilizzando una micropipetta. Eseguire questo passaggio per bloccare i siti non-reagito e per ridurre l'adsorbimento non specifico di proteine ​​in un disco.
  2. Lavare due volte con 0,1% BSA-PBS compilando ed aspirando le camere con una micropipetta.
    NOTA: A questo punto il disco può essere conservato a 4 ° C fino all'utilizzo.
  3. Carico 10 ml di antigene-spillo sangue intero o nel siero privo di CRP per il rilevamento CRP sul disco utilizzando un micropipette. Per rendere i grafici di calibrazione, utilizzare concentrazioni di CRP da 1 pg / ml a 100 ng / ml; e cTnI da 10 pg / ml a 100 ng / ml.
    NOTA: A causa dei livelli elevati di CRP nel sangue intero, che è di solito nella gamma micron, senza siero-CRP è stato utilizzato per dimostrare il limite di rilevamento basso del dispositivo.
  4. Girare il disco a 3.600 rpm (391 xg) per 60 sec per separare i globuli rossi.
  5. Aprire il rubinetto # 1 per irraggiamento laser, e il trasferimento di 4 ml di plasma surnatante alla camera contenente 8 ml di ricerca degli anticorpi coniugati con HRP facendo girare il disco a 2.400 giri al minuto per 3 sec.
    NOTA:. I procedimenti generali per l'azionamento della valvola e la visualizzazione di funzionamento del disco sono descritti in dettaglio in una precedente relazione 21
  6. Applicare una modalità di miscelazione (15 Hz s -1, 15 °) per 5 secondi per il legame degli anticorpi della proteina e rilevamento.
  7. Aprire la valvola # 2, e trasferire il composto preparato al punto 6 alla camera di reazione di legame (2.400 rpm, 3 sec). Quindi, applicare una modalità di miscelazione (60 Hz s -1, 2 °) per 20 minuti per ottenere un immunoreaction tra la miscela e gli anticorpi leganti sui TiO 2 NFs. Dopo la reazione, valvola aperta # 3 e trasferire la miscela residua nella camera di scarico (2.400 rpm, 10 sec).
  8. Trasferire il tampone di lavaggio (600 microlitri) alla camera di reazione di legame aprendo la valvola # 4 e girare il disco (2.400 rpm, 4 sec). Quindi applicare una modalità di miscelazione (30 Hz s -1, 30 °) per 120 secondi per lavare i TiO2 NFs nella camera.
  9. Lavare le TiO2 NFs altre due volte seguendo stessa condizione di passo 3,8, e rimuovere completamente il tampone di lavaggio residua facendo girare il disco a 2.400 rpm per 20 sec. Quindi, chiudere la valvola # 5.
  10. Per la reazione chemiluminescente, applicare un metodo di miscelazione (30 Hz s -1, 2 °) per 1 min dopo il trasferimento della soluzione di substrato chemiluminescente alla camera di reazione di legame aprendo la valvola # 6 e filaturail disco a 2400 rpm per 10 sec successivamente.
  11. Trasferire la soluzione di substrato reagito alle camere di rilevamento aprendo la valvola # 7 e girare il disco a 2.400 rpm per 10 sec.
  12. Misurare segnali chemiluminescenza dalla soluzione di substrato reagito utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) sistema di rilevamento attrezzato modulo.
    NOTA: Il sistema di rilevamento è una macchina su misura utilizzando i seguenti componenti: motore di punto, i componenti ottico-meccanici, fasi di traduzione e disponibile in commercio PMT. Le parti optomechanical e il motore passo sono assemblati per tenere il dispositivo, e il motore può ruotare il disco. La rilevazione viene eseguita da PMT fissato sulle parti optomeccanici, e si trova sopra le camere di rilevamento del dispositivo. Manipolando il motore passo-passo, le camere di rilevamento sono allineati proprio sotto la zona di rilevamento di PMT.

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Risultati

Usando questo protocollo, un dispositivo di microfluidica centrifuga completamente automatizzato per il rilevamento di proteine ​​dal sangue intero ad alta sensibilità è stato preparato. TIO 2 tappetini NF sono stati preparati da processi di elettrospinning e calcinazione. Al fine di realizzare NFS di diametro desiderato, la morfologia e lo spessore, condizioni quali la portata, la tensione, e il tempo spinning electrospinning sono stati ottimizzati. Se le condizioni non sono ...

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Discussione

Il saggio su TiO 2 NF disco integrato è una tecnica rapida, economica e conveniente per la rilevazione ultrasensibile di basse proteine ​​abbondanti presenti in molto basso volume di sangue. Questa tecnica ha il vantaggio di utilizzare piccoli volumi di campione (10 microlitri) ed è suscettibile di analisi di campioni multipli simultaneamente. Questo fornisce un grande potenziale come dispositivo di multiplexing immunologico. Il dispositivo ha il vantaggio che non richiede Campione fasi di pretrattamento come...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per la Ricerca Nazionale di Corea (NRF) sovvenzioni (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), una sovvenzione da parte della Corea Salute Technology R & S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare (A121994) e IBS-R020-D1 finanziata dal governo coreano.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Si waferLG SILTRONPolished Wafer, grado di provaØ (mm) = 150, orientamento = < 100>, drogante = boro, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, spessore (μ m) = 650 - 700
Policarbonato (PC) Daedong Plastic PCS#6900Spessore (mm) = 1 e 5 
Titanio tetraisopropossido, 98%,Sigma-Aldrich205273
Polivinilpirrolidone, Mw = 1,300,000Sigma-Aldrich437190
Acido aceticoSigma-Aldrich320099
Etanolo anidroSigma-Aldrich459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil)-1-triclorosilanoSigma-Aldrich448931
PDMS e agente indurenteDow CorningSYLGARD 184
GPDESGelest IncSIG5832.0 
EtanoloJ T Baker
FE-SEMFEINova NanoSEM
Spettroscopia fotoelettronica a raggi XThermoFisherK-alfa
Macchina di modellazione 3DM& I CNC Lab, CoreaFresatrice CNC
Macchina per l'erogazione della ceraHanra Precision Eng. Co. Ltd., Corea
Nastro biadesivoFLEXcon, USADFM 200 trasparente 150 POLY H-9 V-95
Plotter da taglioGraphtec Corporation, GiapponeGraphtec CE3000-60 MK2
Spin coaterMIDASSPIN-3000D
Fornace (calcinazione)R. D. WEBB COMPANYWEBB 99
Reometro (Tack test)Thermo ScientificHaake MARS  III - Pacchetto
Sistema al plasmadi ossigeno FEMTOCUTE
Topo monoclonale antiumano hsCRPHytest Ltd., Finlandia4C28(clone # C5)
Topo monoclonale anti-cTnIHytest Ltd., Finlandia4T21(clone # 19C7)
HRP capra coniugata policlonale anti-hsCRPAbcam plc., MAab19175
HRP monoclonale di topo coniugato anti-cTnIAbcam plc., MAab24460(clone # 16A11)
hsCRPAbcam plc., MAab111647
cTnIFitzgerald, MA30-AT43
Albumina bovinaSigma-AldrichA7906
PBSAmresco IncE404
Provette per la raccolta del sangueBD vacutainer367844K2 EDTA 7,2 mg più provette per la raccolta del sangue
SuperSignal ELISA femtoInvitrogen37074
Lettore di piastre multilabel modularePerkin ElmerEnvision 2104
Macchina operatrice a discoHanra Precision Eng. Co. Ltd., Corea
Tubo fotomoltiplicatore personalizzato (PMT)Hamamatsu PhotonicsH1189-210
AutoCADAutoDeskVersione 2012Software di progettazione
Software CAD 3D SolidWorks SOLIDWORKS Corp.Versione 2013Software di progettazione 3D,
versione softwareEdgecam2009.01.06928Software di generazione codice
DeskCNCCarken Co.versione 2.0.2.18Software per fresatrice CNC
personalizzato ORM Vero

Riferimenti

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