Dettagli Questo protocollo i passi importanti necessari per la bioconjugation di un cisteina contenente proteine per un maleimmide, tra cui la purificazione dei reagenti, condizioni di reazione, di purificazione e caratterizzazione bioconjugate bioconjugate.
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Articolo metodologico
Sintesi di proteine bioconiugati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il legame chimico o la bioconiugazione di proteine a coloranti fluorescenti, farmaci, polimeri e altre proteine ha una vasta gamma di applicazioni, come lo sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco (ADC) e la nanomedicina, la microscopia fluorescente e la chimica dei sistemi. Per molte di queste applicazioni, la specificità del metodo di bioconiugazione utilizzato è di primaria importanza. L'aggiunta di maleimmidi con cisteina sulle proteine bersaglio è altamente selettiva e procede rapidamente in condizioni blande, rendendola uno dei metodi più popolari per la bioconiugazione proteica.
Dimostriamo qui la modifica dell'unico residuo di cisteina accessibile in superficie sul citocromo c del lievito con una maleimmide di bisterpiridina rutenio (II). La bioconiugazione delle proteine è verificata mediante elettroforesi su gel e purificata mediante cromatografia liquida proteica veloce a base acquosa con una resa del 27% di materiale proteico isolato. La caratterizzazione strutturale con MALDI-TOF MS e UV-Vis viene quindi utilizzata per verificare che la bioconiugazione abbia successo. Il protocollo qui mostrato è facilmente applicabile ad altri accoppiamenti di proteine cisteina - maleimmide ad altre proteine, coloranti, farmaci o polimeri.
Introduzione
Bioconjugation comporta covalentemente collegando una biomolecola con un altro o con una molecola sintetica, come un colorante, farmaco o un polimero. Metodi bioconjugation proteine sono ora ampiamente utilizzate in molti chimica, biologia e nanotecnologia gruppi di ricerca con applicazioni che vanno dal fluorescente etichettatura tintura 1,2, rendendo di proteine (anticorpi) -prodrugs 3 (coniugati anticorpo - ADC) sintesi di dimeri di proteine 4,5 , fino alla ibridi proteina-polimeri autoassemblanti 6,7 utilizzati in nanomedicina 8 e chimica dei sistemi 9.
Specificit....
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Protocollo
Nota: Il seguente protocollo è progettato per la sintesi di un bioconjugate proteina-colorante come mostrato in Figura 1 è un protocollo generale per la reazione di un maleimmide con proteine superficie libera cisteina contenenti, con note inserite eventualmente per assistere con proteine di membrana. bioconiugati, bioconiugati proteina-polimero e dimero proteina sintetica (proteina-proteina) bioconiugati. In questo caso particolare, la proteina iso-1 citocromo c ha una cisteina residui superficie disponibile per reagire che permette un'etichettatura altamente specifico a verificarsi. Se una proteina di interesse ha più residui di cisteina, lo stesso pro....
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Risultati
La sintesi di bioconiugati è confermato da tre metodi principali: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Spettrometria di Massa (MALDI-TOF MS), SDS-PAGE e ultravioletta-visibile spettroscopia (UV-Vis), come illustrato nelle figure 2, 3 e 4. Un aumento di massa corrispondente alla massa della piccola molecola aggiunto, e la mancanza di una proteina non reagito dimostra il legame covalente successo di Ru (II) (tpa) 2 -maleimi.......
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Discussione
Purificazione dei materiali di partenza prima di una bioconjugation è della massima importanza. Proteine ricombinanti ottenuti da fonti commerciali contengono spesso altre isoforme della proteina di interesse, che può avere diverse chimica di superficie e reattività. Ad esempio, nel bioconjugation descritto, il citocromo c commercialmente disponibile contiene una miscela di entrambi iso-1 e iso-2 cit c 12,14,17. Iso-2 e iso-1 forme di citocromo c sono sostanzialmente omologa, con .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'Australian Research Council (ARC) per le sovvenzioni ARC Future Fellowship (FT120100101) e ARC Centre of Excellence CE140100036) a P.T. e al Mark Wainwright Analytical Centre presso UNSW per l'accesso alle strutture di spettrometria di massa e NMR.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| sodio diidrogeno fosfato | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| citocromo c, da saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| ditiotreitolo | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | Colonna a scambio cationico forte da 3,3 ml |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | filtro rotante da 3,5 kDa |
| Mini unità di dialisi Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66333 | Casse per dialisi da 3,5 kDa |
| Ru(II) bisterpiridina maleimmide | Prodotto in | vedi ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| acido etilendiamminotetraacetico | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazolo | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| acetato di nichel | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Colonna Hypercell | Pall | via VWR: 569-1008 | Colonna IMAC da 1 ml |
| Filtro a membrana in cellulosa da 0,2 micron Filtro | Whatman | Z697958 | da 47 mm per tamponi Filtro |
| membrana in PVDF da 0,2 micron | Merck-Millipore | SLGV013SL | filtri per siringhe per proteine |
| acido cloridrico | Sigma-Aldrich | 84426 | Estremamente corrosivi! Prestare attenzione. |
| acido caffeico | Sigma-Aldrich | 60018 | matrice MALDI |
| trifluoroacetico | Sigma-Aldrich | 91707 | estremamente corrosivo! Prestare attenzione |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | proteine prefabbricate |
| SeeBlue Plus2 Proteina precolorata Standard Thermo | Scientific | LC5925 | scala proteica preformata |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | tampone per campioni in gel preconfezionato |
| NuPAGE Agente riducente per campioni (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | Agente riducente in gel preconfezionato |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | Tampone in gel premade |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Spettrofotometro biologico Cary 50 | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q | Merck-Millipore | Acqua ultrapura | |
| Cuvetta UV-Vis a basso volume | Hellma | 105-201-15-40 | Cuvetta da 100 microlitri |
Riferimenti
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality.
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Ristampe e permessi
