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Articolo metodologico

Determinazione del biofilm iniziazione su cellule infettate da virus da batteri e funghi

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DOI:

10.3791/54162

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6 luglio 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

In questo articolo

Sommario

Un metodo è descritto qui per la determinazione dell'associazione e della competizione inter-regno (batterica e fungina) per l'adesione ai monostrati di cellule HeLa infettate da virus. Questo protocollo può essere esteso a più combinazioni di procarioti, eucarioti e virus.

Abstract

Lo studio delle interazioni polimicrobiche attraverso i regni tassonomici che includono funghi, batteri e virus non sono stati precedentemente esaminati rispetto a come i membri virali del microbiome influenzano le successive interazioni microbo con queste cellule ospiti infettate da virus. La convivenza virus con batteri e funghi è principalmente presente sulle superfici mucose della cavità orale e genitale. le cellule delle mucose, in particolare quelli con infezioni virali latenti croniche o persistenti persistenti, potrebbero avere un impatto significativo sulla membri della microbiome attraverso l'alterazione del virus in numero e tipo di recettori espressi. Modifiche nell'architettura membrana della cellula ospite comporterebbe capacità alterato di successivi componenti della flora normale e patogeni opportunisti di avviare il primo passo nella formazione di biofilm, cioè, l'aderenza. Questo studio descrive un metodo per la quantificazione e esame visivo effetto di HSV sulla apertura di Biofilformazione m (aderenza) di S. aureus e C. albicans.

Introduzione

Il microbioma umano comprende diversi organismi da più regni tassonomici che condividono aree geografiche nel corpo. L'adesione alla superficie delle cellule è un primo passo essenziale nella formazione di biofilm, che è parte del processo microbiome colonizzazione. Incluso nel microbiome può essere virus che causano infezioni croniche e persistenti. L'infezione cronica a cellule da questi virus può causare un'alterazione putativo disponibilità del recettore. 1,2 Inoltre, l'ingresso delle cellule da patogeni intracellulari potrebbe anche influenzare la fluidità di membrana host / idrofobia che a loro volta possono alterare l'attaccamento degli altri membri microbiome, compresi batteri e funghi . Al fine di comprendere le interazioni che possono verificarsi tra questi molteplici agenti patogeni che co-localizzano nelle stesse regioni geografiche del ospite umano, dobbiamo essere in grado di studiare l'interazione di agenti patogeni che rappresentano lo spettro di regni tassonomici presenti sulla superficie della mucosa.

t "> Il Herpesviridae sono una famiglia di microbi presenti nel 100% degli esseri umani come membri permanenti del microbiome 3,4. Inoltre, esse possono anche essere persistentemente versato sia in presenza che in assenza di sintomi. In particolare, herpes simplex virus-1 e herpes simplex virus 2 (HSV-1 e HSV-2, rispettivamente) sono membri permanenti del microbiome nella oronasopharynx e del tratto genitale. in individui immuno-competenti, sia HSV-1 e HSV-2 causa gengivostomatite, nonché herpes genitale 5-8. in questi siti, HSV provoca un'infezione latente caratterizzata da persistente asintomatica virale spargimento 9. ingresso di HSV in cellule provoca alterazioni nell'espressione superficiale di nectins, eparan solfato, raft lipidici e herpesvirus ingresso mediatore necrosi cronica / tumorale recettore del fattore (HVEM / TNFR) 10-25. Questi recettori potenzialmente rappresentano condivise per alcuni batteri e funghi, per esempio S. aureus e C. albicans, che pur patogeni opportunisti,può anche risiedere come membri del microbioma mucosa del oronasopharynx 26,27. All'interno del oronasopharynx S. aureus e C. albicans occupano due siti distinti di colonizzazione. In host con denti naturali, la mucosa orale è condiviso da HSV-1 e C. albicans, mentre le narici nasali anteriori sono occupati da S. aureus 28. Tuttavia, nonostante i risultati in vitro in cui S. aureus aderisce alle cellule epiteliali della bocca, 29,30 S. aureus è raramente isolata da campioni orali quando il tessuto normale è presente 29,30. Poco si sa riguardo a genitali nicchie tratto co-colonizzazione al di là dei risultati clinici che S. aureus è associata a vaginite aerobica, caratterizzata da infiammazione genitale, scarico e dispareunia, mentre C. albicans produce lesioni della mucosa simile a quello osservato nella cavità orale 31-35. Così, anche se questi membri della Microbi orale e genitaleome croce regni tassonomici poco si sa sulla loro interazione come urta la loro capacità di avviare la formazione di biofilm attraverso l'adesione alla superficie della cellula ospite 5. Questo protocollo è stato efficacemente applicato a determinare le conseguenze funzionali di co-colonizzazione / infezione.

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Protocollo

1. HSV ceppi e Manipolazione

Nota: ricombinante non diffondere HSV-1 (KOS) gL86 e HSV-2 (KOS) 333gJ - con l'attività reporter di beta-galattosidasi utilizzati sono stati forniti da V. Twiari 36,37.

  1. Utilizzare virus da un singolo lotto e conservare a -80 ° C in un rapporto 1: 1 di mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) con siero fetale bovino 20% (FBS) e latte scremato fino al momento dell'uso. Prima stoccaggio lot virale, determinare la concentrazione di virus o -nitrophenyl-β-D-galattopiranoside (ONPG) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal) dosaggio.
  2. Determinare la vitalità virus e molteplicità di infezione (MOI) di X-Gal colorazione per ogni seduta sperimentale mediante saggio entrata del virus giornalista, come descritto in precedenza (Figura 1) 14.
  3. Diluire il virus (Opt-MEM) a MOI desiderato. Fissare monostrati (paraformaldeide; 0,5 ml / pozzetto) prima della colorazione. Posizionare controlli virus redditività in un microti separataPiastra ter in parallelo con le piastre test polimicrobiche.

2. HeLa 299 Manipolazione cellulare

  1. Crescere a 37 ° C, 5% CO 2 in DMEM con 4,5 g / L di glucosio, 10% inattivato al calore siero fetale bovino (FBS), gentamicina (50 ug / ml) e L-glutammina. cellule Passage a 80% di confluenza con la soluzione di tripsina (acido etilendiamminotetraacetico, 0,53 M EDTA 0,05% tripsina; 5 ml / fiasco).

3. C. Manipolazione albicans

Nota: C. albicans ottenuti da una fonte di laboratorio clinico è conservato a -80 ° C in Remmel latte scremato 2x media.

  1. Cultura congelate Stock su Sabouraud destrosio Medium (37 ° C). Dopo 24 ore la sottocultura C. albicans su terreno Fungisel (37 ° C; 48 HR) per l'uso.
  2. Genera tubo germe (GT) forme (pick colonie rappresentative, 3 ml di FBS, 3 ore; 37 ° C; Abs 600, 0.3). Dopo l'incubazione, lavare GT (HBSS; 2x; 4.000 xg). Aggiungere GT lavata per riscaldato HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). forme GT dovrebbe essere il 99% delle cellule osservate come determinato dal conteggio emocitometro.
  3. Fai la forma di lievito (YF) stock sospensioni con la scelta di colonie rappresentative Fungisel (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Contare il numero di forme YF / ml al microscopio con un emocitometro. forme YF dovrebbero essere il 99% delle cellule osservate come determinato dal conteggio emocitometro.
  4. Fare lavoro stock fungine (250 ml di GT o YF magazzino in 25 ml di HBSS; 37 ° C; 10 5 CFU / ml)

4. S. Manipolazione aureus

  1. Conservare S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel scremato 2x latte). Cultura su agar sangue di pecora (5%; 37 ° C; 24 ore). Scegli colonie rappresentante e trasferimento mannitolo sali media entro 2 giorni per il magazzino (37 ° C; 18 ore).
  2. Fai S. aureus sospensione madre (3 ml di HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 UFC / ml)
    1. Fai S. lavoro aureus azionari (100 pldello stock in 25 ml di HBSS; 10 5 CFU / ml).

5. Candida e S. aureus Sospensioni

  1. Fare misto C. albicans e S. sospensione aureus (250 ml YF o GT magazzino e 100 ml di S. aureus magazzino in 25 ml di HBSS).

6. polimicrobiche biofilm Assay

  1. Seed 96 pozzetti con 200 ml di 2 x 10 5 HeLa cellule / ml (85% livello di confluenza). Lastre di roccia (30 - 45 min; 37 ° C) prima di incubazione (37 ° C, 5% di CO 2 incubatore; 18 h). Monostrati lavaggio (1x; Opt-MEM) poi sementi con HSV (HSV-1 (KOS) gL86 o HSV-2 (KOS) 33 gJ - in 100 ml Opt-MEM; MOI 50 e 10). Incubare le piastre (3 ore; 37 ° C, 5% di CO 2). Utilizzare un solo ceppo virale al giorno.
  2. Lavare monostrati infettati (1x; tampone fosfato (PBS) con Mg +2 e Ca +2; 100 ml). Sostituire PBS con caldo HBSS lasciando 25 & #181; l in ciascun pozzetto.
    1. Aggiungere YF, GT e / o S. sospensioni aureus lavoro (100 ml; porta a rapporto cellulare = 5: 1; n = 16). come indicato nella Tabella 1 Incubare le piastre (statici; 30 min; 37 ° C; 5% CO 2).
  3. Dopo l'incubazione, aspirare una colonna alla volta immediatamente ricarica da 300 ml PBS con Mg +2 e Ca +2. Ripetere questa operazione due volte, quindi aggiungere la radio-immunoprecipitazione tampone di lisi (RIPA; filtro sterilizzato, 200 ml di una diluizione 1:50).
  4. Rapidamente triturate il lisato cellulare HeLa poi posto su 50 pl sali mannitolo (MS) e media / o Fungisel (F) (figura 2). Distribuire il lisato utilizzando una bacchetta di vetro piegata a 90 °. Incubare le piastre (18 ore a 37 ° C). contare manualmente il numero di colonie per piastra. I controlli sono costituiti da S. aureus e / o C. albicans aderenza alle cellule HeLa HSV-non infetti.

7. Gli studi di imaging

  1. Lavare ogni coprioggetto di vetro rotondo (12 mm; 50 ml di acetone in 100 ml bicchiere). coprioggetto secche e sterilizzare (Kimwipes; piatti di vetro Petri). Mettere vetrini sterili a secco nei pozzetti di sterili 24 pozzetti con l'alcool di fiamma pinze sterilizzate.
  2. Aggiungere cellule HeLa (1 ml; il volume 5x utilizzato per 96 pozzetti) ai pozzetti di 24 pozzetti contenenti i vetrini rotondi sterili lavati. Aggiungere i virus, batteri e funghi secondo la dima (Tabella 2) al 5x il volume usato per le piastre a 96 pozzetti, poi incubare e processo come descritto ai punti 6.2.1 a 6.4 sopra.
  3. Dopo l'ultimo lavaggio, fissare le cellule per la microscopia inondando il vetrino con metanolo e permettendogli di evaporare. Conservare le piastre a temperatura ambiente fino a colorazione.
  4. Per microscopia in campo luminoso (1,000x finale ingrandimento originale) riempire i pozzetti contenenti coprioggetto metanolo-fisso con acqua deionizzata. Immediatamente aspirare l'acqua. Coprire ogni vetrino con cristalvioletto Grammi. Lavare coprioggetto libera di macchia non legato (acqua deionizzata). Coprioggetto secchi in situ poi aderire con set mediamente dura ad una slitta etichettato montaggio (Figura 3).
  5. Per la microscopia a fluorescenza (obiettivo 100X; 1,000x originale ingrandimento finale) lavaggio coprioggetto privo di metanolo essenzialmente come descritto al punto 7.4. Asciugare il coprioggetto nei pozzetti.
    1. Dopo l'essiccazione, rimuovere i vetrini e metterli su vetrini etichettati. Quindi aggiungere una quantità sufficiente di diluizione 1:20 di isotiocianato di fluorescina (FITC) coniugata Herpes simplex virus di tipo 1 + 2 GD anticorpi per coprire il vetrino (1 - 5 ml).
    2. Incubare i vetrini in una camera umida a 37 ° C per 30 min. Dopo l'incubazione, lavare i coprioggetti in 4 cambi di PBS.
    3. Dopo l'ultimo lavaggio, restituire il vetrino alla diapositiva etichettati. Macchia con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; camera umida; 37 ° C per 30 min). Dopo l'incubazione lavare i coprioggetti in 4 chanGES di PBS, poi apporre la diapositiva etichettato con set dura mezzo di montaggio.
    4. Lasciare che il mezzo di montaggio per la cura per 24 ore a temperatura ambiente al buio. Esaminare i coprioggetti sotto dell'obiettivo olio sia su un microscopio a campo chiaro o microscopio a fluorescenza con filtri di taglio FITC e DAPI. Esaminate immagini di almeno 50 campi (100 cellule per minimo organismo) per co-localizzazione (Figura 4).

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Risultati

Il livello di solidità dei dati ottenibili da sistema descritto in questa relazione è illustrata nella Figura 2 af 38. Attraverso l'utilizzo di questo sistema di modulazione di interazione stafilococco e funghi con le cellule infettate da virus e il loro effetto sulla reciproca aderenza può essere delineata. Questi tipi di studi richiedono esame microscopico dell'interazione come mostrato nelle figure 3 e 4, 38

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Discussione

Al momento non sono disponibili informazioni sulle interazioni complesse tra permanente ai membri semi-permanenti del microbiome host che attraversano più domini tassonomici, vale a dire, procarioti, eucarioti e virali. Perciò abbiamo sviluppato un nuovo sistema modello in vitro per lo studio del biofilm iniziazione da S. aureus e C. albicans on HSV-1 oppure HSV-2 infettato 229 cellule HeLa 38 (HeLa). Il sistema modello cellule HeLa presenta un vantaggio u...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo progetto è stato supportato dalla Midwestern University, dall'IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) e dal Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
C.albicans
BBL Sabouraud DestrosioBD211584
Fungisel AgarDot Scientific7205A
S.aureus
Mannitol Salt AgarTroy Biologicals7143B
Sangue di pecora agarTroy Biologicals221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, con 4,5 g/L di glucosio e L-glutammina, senza piruvato di sodioCorning10-017-CM
Gentamicin 50 mg/mlSigma139750 µ g/ml concentrazione finale nel DMEM completo
Tripsina EDTA (0,05% tripsina, 0,53 M EDTA)Soluzione 1xCorning25-052-CI
Siero fetale bovinoAtlanta BiologicalsS1115010% concentrazione finale nel DMEM
strong>Other medium and reagents
ONPGThermo Scientific34055
Ultra-Pure X galInvitrogen15520-018
1x HBSS (Soluzione salina bilanciata di Hanks)Corning20-021-CV
1x PBSDot Scientific30042-500
RIPA LysisLife Technologies89901
Staining
MethanolFisher ScientificA433P-4
HSV 1& 2, specifico per gDViroStat196
DAPISIGMAD8417-5MG
Gram Crystal VioletTroy Biologicals212527
Supplies
Petri dish 100 x 15Dot Scientific229693 
Piastra di Petri 150 x 15Kord Valmark2902
Piastre a 96 pozzettiEvergreen Scientific222-8030-01F
Piastre a 24 pozzettiEvergreen Scientific222-8044-01F
Provette per coltura 100 x 13Thomas Scientific9187L61
Cerchi di copertura, 12 mmDeckglaserCB00120RA1
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Riferimenti

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