È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Continua infusione endovenosa è la Strada del trattamento scelta per arginina-vasopressina bloccante dei recettori conivaptan nei topi per studiare Stroke-evocato Cervello Edema

8.5K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54170

⸱

1 settembre 2016

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

In questo articolo

Sommario

I nostri studi hanno rivelato che gli effetti benefici del conivaptan dipendono dal metodo di somministrazione dopo l'ictus sperimentale nei topi. Abbiamo sviluppato un protocollo di ricerca per la somministrazione del bloccante del recettore tramite catetere endovenoso sulla formazione di edema cerebrale evocato da ictus nei topi.

Abstract

L'ictus è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo. Ictus è complicata da edema cerebrale e altri eventi fisiopatologici. Tra i giocatori più importanti per lo sviluppo e l'evoluzione di edema cerebrale ictus-evocato è l'ormone arginina-vasopressina e dei suoi recettori, V1a e V2. Recentemente, il bloccante dei recettori conivaptan V1a e V2 ha continuato ad attrarre l'attenzione come un potenziale farmaco per ridurre l'edema cerebrale dopo ictus. Tuttavia, i modelli animali che coinvolgono applicazioni conivaptan nella ricerca corsa devono essere modificati sulla base di percorsi praticabili di somministrazione. Ecco i risultati di 48 ore endovenosa continua (IV) sono confrontati con i trattamenti intraperitoneale (IP) conivaptan dopo l'ictus sperimentale nei topi. Abbiamo sviluppato un protocollo in cui occlusione dell'arteria cerebrale media è stato combinato con l'installazione del catetere nella vena giugulare per il trattamento IV di conivaptan (0,2 mg) o veicolo. Diverse coorti di animali sono stati trattati con 0,2mg in bolo di conivaptan o di un veicolo IP quotidiana. Sperimentale ictus-evocato edema cerebrale è stata valutata in topi dopo IV continuo e trattamenti IP. Il confronto dei risultati è emerso che la somministrazione IV continua di conivaptan allevia post-ischemica edema cerebrale nei topi, a differenza della somministrazione IP di conivaptan. Concludiamo che il nostro modello può essere utilizzato per i futuri studi di applicazioni conivaptan nel contesto di ictus e di edema cerebrale.

Introduzione

L'ictus continua ad essere un enorme fardello per pazienti e medici. I modelli di ictus di animali sono stati utilizzati in laboratorio per quasi due decenni. 1 Ciononostante, i trattamenti sperimentali che funzionano negli animali spesso falliscono nell'uomo. 2 Questa discrepanza nei risultati del trattamento può essere dovuta a vari fattori, come le vie di somministrazione dei farmaci utilizzati nella ricerca sugli animali, il metabolismo e il tasso di eliminazione dei farmaci e molti altri aspetti. Una delle principali complicanze dell'ictus, l'edema cerebrale, è al centro dell'attuale ricerca nel campo delle neuroscienze. I meccanismi di formazione dell'edema cerebrale coinvolgono disturbi dell'acqua e dell'equilibrio elettrolitico innescati dalla risposta arginina-vasopressina (AVP) al danno cerebrale ischemico. 3 Pertanto, l'AVP e i suoi recettori (V1a e V2) sono al centro degli studi di ricerca sulla formazione di edema cerebrale post-ischemico. 3

Abbiamo sviluppato una metodologia per studiare gli effetti del bloccante del recettore misto arginina-vasopressina (V1a e V2) conivaptan sull'edema cerebrale post-ischemico nei topi. 4 I bersagli molecolari del conivaptan5 rendono il farmaco un candidato adatto per l'esplorazione delle sue proprietà nell'alleviare l'edema cerebrale. Inoltre, il conivaptan deve essere studiato nel contesto degli eventi fisiopatologici dell'ictus. 6 Nel progettare questo studio, abbiamo preso in considerazione il confronto dei risultati del trattamento utilizzando due diverse vie di somministrazione di conivaptan: endovenosa (IV)4 e intraperitoneale (IP). 7 Sono stati valutati gli effetti dei trattamenti sull'edema cerebrale indotto da ictus. Qui vengono descritti protocolli dettagliati per l'induzione chirurgica dell'ictus sperimentale mediante occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) e seguiti da un trattamento continuo con conivaptan mediante l'installazione di un catetere IV giugulare. Dopo l'induzione dell'ictus, gli animali sono stati assegnati in modo casuale ai seguenti gruppi: veicolo o conivaptan (0,2 mg/die) trattati per via endovenosa o IP.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso di animali nella ricerca e sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali e Usa Swedish Medical Center. Tutte le procedure sono state eseguite con opportune tecniche asettiche. animali da laboratorio utilizzati per lo studio erano di sesso maschile, 3 mesi di età, wild type topi C57 con il peso corporeo dal 25 al 27 g.

1. In Vivo fase di aspirazione

  1. Pre-coat il filamento con resina dentale prima dell'intervento.
    1. Tagliare un pezzo lungo 12 millimetri di filamento da una sutura 7-0 in nylon. Mescolare 2 parti di resina con 1 parte di induritore, e poi immergere immediatamente la punta del filamento nella miscela per coprire circa 1/3 della sua lunghezza. Rimuovere rapidamente e verificare che sia coperto con un cappotto superficie liscia di resina dentale.
    2. Far asciugare il filamento per 2 ore prima dell'uso.
  2. Posizionare il mouse in unn camera di induzione dell'anestesia (2 volumi L), e impostare il flusso di 1,5% isoflurano nel 25% di aria arricchita di ossigeno camera a 2 L / min andare nella camera.
  3. Lasciare che il mouse per rimanere in camera di induzione fino a completo anestetizzato, 8 come determinato dalla mancanza di risposta alla coda pizzico.
  4. Posizionare il mouse sul tavolo operatorio con un tampone riscaldato, e impostare la concentrazione di isoflurano a 1% per il mantenimento dell'anestesia consegnato spontaneamente attraverso il cono di naso.
  5. Clip capelli sulla parte anteriore e la parte posteriore del collo, e spruzzare collo con alcool. Applicare veterinaria pomata oftalmica su entrambi gli occhi.
  6. Per monitorare costantemente la temperatura corporea, utilizzare una sonda temperatura rettale collegata al display digitale durante l'intervento chirurgico.
  7. Posizionare il mouse in posizione supina, applicare la soluzione macchia 10% iodopovidone per la disinfezione, coprire con un telino sterile, e poi fare una incisione mediana lungo il collo con una dimensione di 10 bisturi chirurgico.
  8. temporaneamente legare l'arteria sinistra carotide comune (CCA) con sutura 6.0 seta.
  9. Posizionare un altro legame sulla carotide esterna sinistra (ECA).
  10. Inserire una clip microvascolare sulla carotide interna (ICA).
  11. Tagliare un piccolo foro sulla carotide esterna con le forbici microvascolari. Inserire un filamento fatta 7-0 sutura in nylon rivestito con resina dentale nell'apertura della Corte dei conti, e avanzare cefalicamente, durante la rimozione del clip, fino a quando si avverte resistenza (circa 5-7 mm dal punto di biforcazione della CCA).
  12. Inserire un legame temporanea sulla carotide interna per fissare il filamento in posizione. Fare riferimento al diagramma, figura 1A. Chiudere la pelle con suture di seta, e infiltrarsi la ferita sul fronte del collo con 0,2 ml di bupivacaina 0,5%, come nel passo 2.6.
  13. Lasciare che il mouse per risvegliare dall'anestesia e riguadagnare la coscienza in una camera di recupero per 60 min. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistatocoscienza sufficiente per mantenere prona sternale.
  14. Testare il mouse per il neurologica deficit di punteggio (NDS) come segue: 0 = normale funzione motoria, 1 = flessione del busto e della zampa anteriore controlaterale sulla sponda idraulica, 2 = girando verso il lato controlaterale, ma la postura normale a riposo, 3 = appoggiandosi al controlaterale lato a riposo, 4 = nessuna attività motoria spontanea. 4,9
    1. Per il test NDS, sollevare topo per la coda e posto su una superficie piana per l'osservazione (2-3 min). In alternativa, osservare topi in camera di recupero. Escludere i topi che presentano NDS inferiore al 2 dall'esperimento a causa di insufficiente occlusione della MCA.
      Nota: tecnica laser Doppler flussimetria può essere utilizzato per confermare MCA occlusione 9-11.
  15. Re-anestetizzare l'animale dopo 60 min di recupero nella camera di induzione come sopra descritto, ri-sterilizzare la precedente incisione cutanea con soluzione scrub povidone-iodio 10%, e riaprire la ferita chirurgica sulladavanti al collo tagliando e rimuovendo la sutura di seta.
  16. Per rimuovere il filamento dalla Corte dei conti effettuare le seguenti operazioni:
    1. Posizionare una clip microvascolare sul ICA. Sciogli la sutura sul ICA e tirare il filamento fuori mentre si tiene la clip aperta.
    2. Chiudere la clip e posizionare un pareggio sul ECA prossimale al taglio.
    3. Rimuovere il morsetto e rimuovere la legatura del CCA per ripristinare il flusso di sangue al cervello. Fare riferimento al diagramma, figura 1B.

2. Installazione di IV catetere nella vena giugulare per il trattamento continuo 48 ore

Nota: procedere all'installazione del catetere subito dopo la fase 1.16.3 senza risveglio del mouse.

  1. Utilizza due diverse dimensioni di tubi flessibili: inserire il tubo interno (0,94 mm di diametro esterno, per contenere il farmaco infuso) nel tubo esterno (3,18 mm di diametro esterno, per la protezione del tubo interno).
  2. Pallacciare il mouse nella posizione prona, applicare la soluzione scrub povidone-iodio 10% per la disinfezione, e fare 1 cm un'incisione sul retro del collo con una taglia 10 bisturi chirurgico. Ruotare il mouse in posizione supina, ri-sterilizzare la parte anteriore del collo con soluzione scrub povidone-iodio 10%, e riaprire la ferita chirurgica sulla parte anteriore del collo. Tunnel il tubo sotto la pelle dal incisione fatta sul retro verso la parte anteriore del collo, e esteriorizzare dalla ferita aperta 1 cm.
  3. Rimuovere tessuto adiposo sottocutaneo dal lato sinistro della parte anteriore del collo circa 1 cm lateralmente dalla linea mediana. Individuare la vena giugulare sinistra, posizionare due legami lungo la vena 5 mm l'uno dall'altro, e un po 'allungare la vena. Fare un piccolo foro sulla vena giugulare tra i due legami con le forbici microvascolari; inserire la punta del tubo interno 5 millimetri caudalmente profondità (verso il cuore).
  4. Fissare il tubo con entrambe legami con la vena giugulare. Chiudere la pelle sulla parte anteriore del collo conuna sutura 3-0 seta. Fare riferimento al diagramma, figura 1C.
  5. Fissare il tubo alla pelle sul retro del collo con una sutura, e collegare il tubo ad una pompa microinfusion IV attraverso una girevole. Il girevole permette la libera circolazione di topi all'interno della gabbia con pieno accesso al cibo e all'acqua.
  6. Infiltrati le incisioni cutanee sulla parte anteriore e la parte posteriore del collo con 0,2 ml di 0,5% bupivacaina per prevenire il dolore post-operatorio.
    Nota: A seconda dei protocolli specifiche di polizia istituzionali, gli animali possono essere trattati con oppioidi, i FANS, o antibiotici pre e post-operatorio. Tuttavia, i trattamenti menzionati possono alterare i risultati di esito ictus ischemico (vedi la discussione sezione). 11-14
  7. Lasciare che l'animale per risvegliare nella camera di recupero, e quindi ospitare l'animale in una gabbia separata fino al punto di fine dell'esperimento. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere sternaleprona.
  8. Impostare la velocità di infusione per 48 ore in continuo trattamento IV di conivaptan (0,14 mg / ml in 5% di destrosio) o un veicolo a 1,5 ml / kg / ora, 4 e iniziare l'infusione.
    Nota: La quantità totale di IV conivaptan infuso dovrebbe essere di circa 0,2 mg / topo / giorno in un volume totale di 1,44 ml.
    Nota: Eseguire iniezione intraperitoneale (IP) di conivaptan due volte al giorno con quantità totale di 0,2 mg in 1,44 ml di 5% di destrosio. Implementare iniezione IP è stato come precedentemente descritto. 15 Restrain topi afferrando la pelle della superficie posteriore del corpo e la coda. Iniettare conivaptan o di un veicolo nel quadrante in basso a sinistra dell'addome con un / 1 ago pollice 26 G / 2. 15
  9. Osservare gli animali due volte al giorno per tutta la durata dell'esperimento (48 ore). Consentire agli animali di avere pieno accesso al cibo e all'acqua. Se l'animale mostra segni di sofferenza o di dispnea consultare un veterinario. Se eutanasia è necessario per l'animale in grave distress fare riferimento al punto 3.1 di seguito, ed escludere l'animale dallo studio.

3. Valutazione della Stroke-evocata edema cerebrale al punto finale

  1. Sacrificare il mouse da un eccesso di anestetizzare con il 5% isoflurano.
  2. Utilizzare un bisturi per fare una incisione pelle sopra l'osso del cranio lungo la linea mediana, e ritrarre la pelle per esporre l'intero cranio sopra cervello. Iniziando il foro occipitale, tagliare l'osso del cranio lateralmente lungo il perimetro del cervello su ogni lato, e sollevare con attenzione senza toccare il cervello sottostante. Sever cervello dalla colonna vertebrale e nervi attaccati alla base del cranio.
  3. Rimuovere il cervello, separarlo dal bulbo olfattivo e il cervelletto, e sezionare il cervello lungo la fessura interemisferica in emisferi cerebrali ischemici e non ischemici, come descritto in precedenza. 9
  4. Valutare edema cerebrale confrontando wet-to-dry rapporti (WDR) come descritto in precedenza 4,9. pesare i tessutiprima e dopo essiccazione per 3 giorni a 100 ° C in un forno. Calcolare il contenuto d'acqua del cervello (BWC) in% H 2 O = (WT 1-asciutto. / Peso bagnato.) X 100%.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La temperatura corporea degli animali è stata nel range fisiologico e stabile durante tutta la procedura chirurgica dell'induzione ictus. Due topi che mostravano NDS inferiore a 2 subito dopo MCAO sono stati esclusi dallo studio.

MCAO nei topi produce il volume dell'infarto nell'emisfero ipsilaterale a 48 ore. Valutazione delle fette TTC-macchiato mostra che circa il 50% dell'emisfero è affetto da infarto dopo ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo studio ha un valore importante per la ricerca preclinica ictus. Questo studio rivela che continua infusione endovenosa di conivaptan (0,2 mg / die) dopo ictus sperimentale nei topi riduce efficacemente l'edema cerebrale dopo 48 ore di trattamento. L'effetto di iniezione IP la stessa dose di conivaptan su edema cerebrale è stato anche indagato. trattamento conivaptan da entrambe le vie IV e IP produce acquaresi nei topi, come indicato da: 1) aumento della osmolalità plasmatica leggermente al di sopra i liv...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Swedish Medical Center per fornire il finanziamento e strutture. Ringraziamo anche Craig Hospital per l'uso generoso di spazio di laboratorio.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pad riscaldatoK& Monitor di temperatura H Manufacturing Inc1060
con sonda rettalePhysitemp7029
, sutura in seta 6-0Surgical Specialties CorporationSP114
3-0Ethicon1684G
7-0Ethicon1696G
con indurenteHeraeus Kulzer65817930
Pompa per microinfusione IVKent ScietificGT0897
Girevole 22GAInstech375/22PS
Tubo da laboratorio, 0,94 mm x 0,51 mmDow Corning508-002
Tubo da laboratorio, 3,18 mm x 1,98 mmDow Corning508-009
Bobina di sutura in seta su ago, sutura in nylon , polisilossano in resina dentale

Riferimenti

  1. Gueniau, C., Oberlander, C. The kappa opioid agonist niravoline decreases brain edema in the mouse middle cerebral artery occlusion model of stroke. J Pharmacol Exp Ther. 282, 1-6 (1997).
  2. Krafft, P. R., et al. Etiology of stroke and choice of models. Int J Stroke. 7, 398-406 (2012).
  3. Vakili, A., Kataoka, H., Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 25, 1012-1019 (2005).
  4. Zeynalov, E., Jones, S. M., Seo, J. W., Snell, L. D., Elliott, J. P. Arginine-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan Reduces Brain Edema and Blood-Brain Barrier Disruption after Experimental Stroke in Mice. PloS one. 10, e0136121(2015).
  5. Med Lett Drugs Ther.. Conivaptan (Vaprisol) for hyponatremia. The Medical letter on drugs and therapeutics. 48, 51-52 (2006).
  6. Zhao, X. Y., et al. Effect of arginine vasopressin on the cortex edema in the ischemic stroke of Mongolian gerbils. Neuropeptides. 51, 55-62 (2015).
  7. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans Blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195, 206-210 (2011).
  8. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Curr Protoc Mouse Biol. 5, 51-63 (2015).
  9. Zeynalov, E., et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med. 36, 2634-2640 (2008).
  10. Zeynalov, E., Dore, S. Low doses of carbon monoxide protect against experimental focal brain ischemia. Neurotox Res. 15, 133-137 (2009).
  11. Zeynalov, E., Nemoto, M., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Neuroprotective effect of selective kappa opioid receptor agonist is gender specific and linked to reduced neuronal nitric oxide. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 414-420 (2006).
  12. Ma, M. C., Qian, H., Ghassemi, F., Zhao, P., Xia, Y. Oxygen-sensitive {delta}-opioid receptor-regulated survival and death signals: novel insights into neuronal preconditioning and protection. J Biol Chem. 280, 16208-16218 (2005).
  13. Ahmad, M., Zhang, Y., Liu, H., Rose, M. E., Graham, S. H. Prolonged opportunity for neuroprotection in experimental stroke with selective blockade of cyclooxygenase-2 activity. Brain Res. 1279, 168-173 (2009).
  14. Meisel, C., et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke. 35, 2-6 (2004).
  15. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, 250-251 (1969).
  16. Adis International Limited. Conivaptan: YM 087. Drugs in R&D. 5, 94-97 (2004).
  17. Murphy, T., Dhar, R., Diringer, M. Conivaptan bolus dosing for the correction of hyponatremia in the neurointensive care unit. Neurocrit Care. 11, 14-19 (2009).
  18. Liu, X., Nakayama, S., Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P., Bhardwaj, A. Arginine-vasopressin V1 but not V2 receptor antagonism modulates infarct volume, brain water content, and aquaporin-4 expression following experimental stroke. Neurocrit Care. 12, 124-131 (2010).
  19. Wallace, B. K., Jelks, K. A., O'Donnell, M. E. Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases. Am J Physiol Cell Physiol. 302, C505-C517 (2012).
  20. O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
  21. Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
  22. Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Somministrazione di ConivaptanTrattamento intraperitonealeOcclusione dell'arteria cerebrale mediaCateterizzazione della vena giugulareValutazione dell'edema cerebraleModello murino di ictusVia di somministrazione del farmacoBloccante dei recettori V1a e V2Edema cerebrale post-ischemico
Continua infusione endovenosa è la Strada del trattamento scelta per arginina-vasopressina bloccante dei recettori conivaptan nei topi per studiare Stroke-evocato Cervello Edema
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.