Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per la conversione diretta di fibroblasti embrionali murini in cellule staminali del trofoblasto completamente funzionali e stabili mediante sovraespressione di dieci giorni di Tfap2c, Gata3, Eomes ed Ets2.

Abstract

cellule staminali Trophoblast (TSC) sono una conseguenza della prima decisione destino cellulare in sviluppo dei mammiferi. Essi possono essere coltivate in vitro, mantenendo la capacità di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in tutti i sottotipi del lineage trofoblasto, equivalenti in vivo staminali popolazione cellulare dando luogo alla parte fetale della placenta. Pertanto, TSC offrono un modello unico per studiare lo sviluppo placentare ed embrionale rispetto a extra-embrionali decisione destino della cellula in vitro. Dal stadio di blastocisti in poi, una barriera epigenetica distinta composto da metilazione del DNA e degli istoni modifiche separa ermeticamente entrambe le linee. Qui, descriviamo un protocollo per superare questa barriera completamente lignaggio da transitori sovra-espressione del trofoblasto regolatori chiave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 in fibroblasti embrionali murini. Le cellule staminali del trofoblasto indotte sono in grado di auto-rinnovarsi e sono quasi identiche a blastocisti di cellule staminali derivate trofoblasto in termini di morfologia, l'espressione del gene marcatore e modello di metilazione. Funzionale in vitro e in vivo confermano che queste cellule sono in grado di differenziarsi lungo lignaggio trofoblasto generare cellule giganti poliploide trofoblasto e chimerizing la placenta quando iniettato in blastocisti. L'induzione di cellule staminali dal tessuto trofoblasto somatica apre nuove strade per studiare le caratteristiche genetiche ed epigenetiche di questo lignaggio extra-embrionale e offre la possibilità di generare linee di cellule staminali trofoblasto senza distruggere l'embrione rispettivo.

Introduzione

Recentemente, uno studio di confronto diversi approcci di topo cellule staminali embrionali di trofoblasto conversione delle cellule staminali ha rivelato che in tutti i sistemi analizzati, la conversione lignaggio è rimasto incompleto. Invece di cellule staminali indotte (trofoblasto) iTSCs cosiddette staminali trofoblasto cellule simili alle cellule sono stati generati conservando un ricordo del destino delle cellule di origine ^1. Qui, abbiamo seguito un approccio diverso di generazione ITSC. Simile a l'induzione diretta di cellule staminali pluripotenti da murine fibroblasti embrionali (MEF) ^2, iTSCs sono stati convertiti direttamente dal tessuto somatica differenziata. In primo luogo, abbiamo identificato 12 fattori che inducono candidati TSC destino quando sovraespresso in MEF. In seguito, i fattori Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 sono stati identificati per essere necessaria e sufficiente per l'induzione ITSC ^3. Allo stesso tempo, un altro gruppo ha trovato modo indipendente Tfap2c, GATA3 e Eomes essere sufficiente per convertire MEF in iTSCs. Tuttavia, in talestudio, il tempo richiesto per l'espressione del transgene è notevolmente più lungo rispetto al nostro studio, che indica diverse cinetiche di conversione, quando ETS2 è assente dal transdifferenziamento cocktail ^4.

Siero fetale bovino convenzionale (FBS) contenente coltura di cellule staminali del trofoblasto blastocisti derivate indotte e si basa sulla presenza di fattori di crescita secreti dal MEF inattivati ^​​5,6. Durante l'induzione ITSC, questi fattori sono forniti da MEF, che non hanno la piena combinazione di transgeni e non sono sottoposti a transdifferenziamento. Tuttavia, una volta singole colonie ITSC sono sub-coltura, richiedono mezzi di comunicazione, che è stato condizionato dal MEF crescita inattivati. Da lì in poi, iTSCs possono essere coltivate e trattati come blastocisti derivate TSC secondo protocolli standard. Da segnalare, in contrasto con Tanaka et al. ^5, abbiamo quotidianamente cultura TSC e iTSCs senza gelatinizzanti piatti di coltura cellulare.

Protocollo

Tutti gli esperimenti di topo sono stati condotti secondo la legge tedesca di protezione degli animali e in accordo con l'approvazione dei comitati per la cura degli animali istituzionali locali (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nord Reno-Westfalia [numero ID di approvazione: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. Carta Preparazione

1. Preparare 293T media: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) di FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato di sodio (1 mM), penicillina / streptomicina (1x).
2. Preparare medio MEF: DMEM, 10% (v / v) di FBS, L-glutamina (2 mM), aminoacidi non essenziali 1x, penicillina / streptomicina (1x).
3. Preparare medio TS (w / o FGF4 / eparina): Roswell Park Memorial Institute media (RPMI) 1640, il 20% (v / v) di FBS (cellule staminali cultura grado), penicillina / streptomicina (1x), L-glutammina (2 mm ), piruvato di sodio (1 mM), 2-mercaptoetanolo (0,1 mM).
4. Preparare medio TS con FGF4 / eparina (TS + F4H): RPMI 1640, il 20% (v / v) di FBS (cellule staminalicultura grade), penicillina / streptomicina (1x), L-glutamina (2 mM), piruvato di sodio (1 mM), 2-mercaptoetanolo (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 mg / ml di eparina.
   Nota: FGF4 ed eparina sono aggiunti direttamente nelle supporto immediatamente prima dell'uso.
5. Preparare TS-CM con FGF4 / eparina (TS-CM + F4H): 70%-MEF condizionata TS media + 30% preparata al momento TS media + 25 ng / ml FGF4, 1 mg / ml di eparina.
   Nota: FGF4 ed eparina sono aggiunti direttamente nelle supporto immediatamente prima dell'uso.
6. Preparare medio Trasfezione: Avanzato DMEM, 2% (v / v) di FBS (radice di grado coltura cellulare), L-glutammina (2 mm), la penicillina / streptomicina (1x).
7. Preparare medio Virus-produzione: Avanzato DMEM, 5% (v / v) di FBS (radice di grado coltura cellulare), L-glutammina (2 mm), la penicillina / streptomicina (1x).

2. murino embrionale Fibroblasto Derivazione

1. Set accoppiamenti a tempo utilizzando peso 129S2SV femmine e maschi omozigoti topi R26 :: rtTA (nome ceppo; B6.Cg-Gt (Rosa) 26Sor ^{TM1 (rtTA}* M2) Jae / J 7). Su E13.5 topi sacrificio dislocazione cervicale e isolare fibroblasti primari murini embrionali (MEF) secondo protocolli standard ^8. Successivamente, le cellule piastra da un embrione su un piatto di 150 millimetri in MEF media.
2. Una volta che le culture MEF primarie raggiungano la confluenza su piatti di 150 mm, lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS e aggiungere 4 ml 0,05% soluzione di tripsina / EDTA. Incubare piatti per 3 - 4 minuti in incubatrice a 37 ° C.
3. Dopo incubazione verifica se le cellule staccate dal piatto utilizzando un microscopio invertito (utilizzando un obiettivo 10X). Aggiungere 5 ml di media MEF per fermare tripsinizzazione e raccogliere sospensione cellulare in un tubo conico da 50 ml.
4. sospensione cellulare Pool da diversi piatti raccogli in una provetta conica da 50 ml. sospensione cellulare centrifugare per 3 minuti a 200 xg e 10 ° C.
5. Gettare il surnatante e risospendere pellet in cella FBS contenente il 10% (v / v) dimetilsolfossido. Congelare MEF in aliquote per un ulteriore uso.
   Nota: In alternativa, utilizzare tip selvaggioe MEF primarie; tuttavia, un ulteriore vettore lentivirale che esprime rtTA deve essere trasdotte insieme agli altri vettori lentivirali (per esempio usando il plasmide FUdeltaGW-rtTA descritto da Maherali et al. ^9).
6. Preparazione del mezzo TS MEF condizionata
   Nota: Prima di esperimenti di conversione, MEF condizionata (CM) TS supporto deve essere preparato, che è richiesto per sottocultura di singole linee ITSC (descritti nella sezione 6).
   1. Piastra 1 x 10 ⁷ MEF mitoticamente inattivati ​​al piatto 150 mm di media MEF sul numero desiderato di piatti. Inattivare MEF di γ-irraggiamento con una dose di 9 Gy.
      Nota: La resa per piatto 150 millimetri è di circa 60 ml di CM.
   2. Il giorno dopo la placcatura, aspirare e scartare medio MEF e aggiungere 20 ml preparati al momento medie TS (senza FGF4 / eparina) su ogni piatto di MEF e luogo piatti mitoticamente inattivato di nuovo nel incubatore a 37 ° C.
   3. dopo l'incubazionemedia TS per tre giorni sul MEF mitoticamente inattivati, raccogliere media in 50 ml provette coniche. Filtrare media attraverso un filtro 0,2 micron e procedere con la 2.6.4. Sostituire CM con 20 ml di terreno fresco TS per la preparazione di un ulteriore lotto di CM.
      Nota: mitoticamente MEF inattivati ​​possono essere utilizzati per la preparazione CM fino a tre volte.
   4. Aliquota 35 ml di CM filtrato in 50 ml provette coniche e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Dopo lo scongelamento, aggiungere 15 ml di terreno TS preparati al momento al fine di ottenere il 70% TS-CM e conservare a 4 ° C per un massimo di un mese.

3. vettori lentivirali Produzione in cellule 293T

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti nello spazio di laboratorio in licenza a livello di biosicurezza 2.

1. Prima di esperimenti di conversione, preparare vettori lentivirali per la doxiciclina (DOX) dipendenti over-espressione di Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2 e mCherry. Per ogni lentivirus, le cellule 293T co-trasfezione utilizzando ilrispettivo vettore di trasferimento lentivirale insieme ad un plasmide imballaggio e una busta esprimendo plasmide VSV-G (per informazioni plasmide riferimento alla Tabella Materials).
   Nota: per informazioni utili per quanto riguarda la produzione di virus si riferiscono a Gavrilescu et al ^10.. Anche se descrive la produzione di retrovirus, osservazioni di carattere generale in materia di qualità delle cellule 293T e il DNA plasmide sono vere per la produzione di lentivirus pure.
   ATTENZIONE: le misure di sicurezza appropriate devono essere prese, quando si lavora con vettori lentivirali e il lavoro deve essere eseguito in una struttura biosicurezza di livello 2.
2. Coat cinque 100 piatti mm con soluzione coprendo i piatti con 5 ml di soluzione e delicatamente dondolo per distribuire uniformemente soluzione di rivestimento di poli-L-lisina (100 mg / ml). Porre le capsule di nuovo nel incubatore a 37 ° C per 30 min. Dopo 30 min soluzione di rivestimento aspirare e lavare i piatti una volta con PBS.
3. Tavola 7 x 10 ⁶ 293T cellule per piatto a 10 ml mezzi 293T-cellule, spiatti Wirl per distribuire uniformemente le cellule e posto i piatti di nuovo nel incubatore a 37 ° C.
4. La mattina seguente, sostituire terreno di coltura con 5 ml di terreno trasfezione. Aggiungere 6 ml di una 1,000x magazzino di soluzione clorochina (25 mm) e posizionare i piatti di nuovo nel incubatore a 37 ° C.
5. Nel frattempo, preparare la miscela di trasfezione:
   1. Per ogni vettore lentivirale preparare due 5 ml provette, etichettate A e B.
   2. Aggiungere 600 ml di 2x HEPES Buffered Saline (HBS) per tubo A.
   3. Nel mix tubo B 61,5 ml soluzione di CaCl ₂ (2 m), con 18,5 mcg lentivector DNA e 9,25 mg psPAX2 e 9,25 mg di pMD2.G. Regolare il volume a 600 ml con la cultura sterile di grado H ₂ O.
   4. Aggiungere la soluzione dal tubo di B goccia a goccia a tubo A mentre vortex. Incubare miscela di trasfezione per 15 minuti a RT.
6. Aggiungere miscela di trasfezione con molta attenzione cadere saggio le cellule 293T preparati sul piatto a 100 mm. UNopo 5 a 6 ore rimuovere medie e sostituire con 10 ml di terreno virus-produzione. Mettere i piatti di nuovo nel incubatore a 37 ° C.
   Nota: Fare attenzione durante la rimozione e la sostituzione di media da cellule 293T facilmente si staccano dal piatto. variazione media 5-6 ore dopo la trasfezione è fondamentale, dal momento che l'esposizione prolungata alla clorochina è tossico per le cellule.
7. La mattina seguente, rimuovere con attenzione e gettare media e sostituirlo con 7 ml di terreno virus-produzione.
8. Il mattino successivo alla vendemmia il primo lotto di media virus contenenti. Aspirare media e raccogliere in un tubo da 15 ml. Ancora una volta, aggiungere 7 ml di mezzo di virus-produzione sulle celle. Conservare virus contenente il mezzo in frigo fino a quando il secondo lotto è raccolto il giorno seguente.
9. La mattina successiva aspirare il secondo lotto di terreno contenente il virus aggiungendola ai 15 ml tubo conico contenente il primo lotto. cellule 293T possono ora essere scartati. Filtro virus contenente il mezzo attraverso un sur 0,45 micronacetato di cellulosa senza factant filtro -membrane. Aliquota filtrato, virus contenenti medio e conservare a -80 ° C per un ulteriore uso.
   Nota: la produzione di virus può essere eseguita anche in piatti 6 pozzetti. Ridimensionare volumi e numero di cellule di conseguenza.

4. fibroblasti trasduzione con 4 fattori e mCherry controllo vettoriale

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in una struttura di biosicurezza di livello 2.

1. Per una rappresentazione schematica del contorno sperimentale riferimento alla Figura 1. Scongelare un'aliquota di primarie rtTA-MEF e piastra 3,33 x 10 ⁵ cellule per pozzetto di un piatto 6 pozzetti in un volume totale di 2 ml di supporti MEF. Preparare almeno 3 pozzi ed etichettarli con 4 fattori (4F), mCherry e controllo.
   Nota: In alternativa, MEF tipo selvatico possono essere utilizzati, quando un rtTA esprime vettori lentivirali viene aggiunto al cocktail lentivector durante la fase 4.2.
2. Il giorno seguente dopo che le cellule pienamente recuperato da cryopreconservazione, sostituire i media MEF nelle tre 6-pozzi con 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) e 1 ml (controllo) dei mezzi di trasduzione, rispettivamente. Scongelare una aliquota di PLV-teto-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets e virus -mCherry a temperatura ambiente e aggiungere 100 ml di ogni surnatante virus contenenti (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) nel 4F bene.
   Nota: In caso di MEF wild type, ridurre il volume dei mezzi di comunicazione preplated da 100 ml e inoltre aggiungere 100 ml di virus FUdeltaGW-rtTA contenente surnatante al mix 4F.
3. Aggiungere 100 ml di mCherry supporti virus contenenti al pozzo etichettato con mCherry. Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 8 mg / ml in ogni pozzetto. Porre la capsula posteriore in incubatore a 37 ° C e incubare MEF O / N con surnatante contenente il virus.
   Nota: In caso di MEF wild type, ridurre il volume dei mezzi di comunicazione preplated da 100 ml e inoltre aggiungere 100 ml di FUdeltaGW-rtTA surnatante virus contenenti.
4. La mattina seguente, rimuovere con attenzionemedia e contenente il virus, lavare tre volte con 2 ml di PBS. Infine, aggiungere 2 ml di TS Media (senza FGF4 / eparina).
   Nota: MEF trasdotte possono sia essere utilizzati direttamente per esperimenti di induzione ITSC o congelati per un ulteriore uso.

5. fibroblasti di conversione ITSC

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti nello spazio di laboratorio in licenza a livello di biosicurezza 2.

1. Lavare MEF trasdotte due volte con 2 ml di PBS e dopo l'aggiunta soluzione di 0,5 ml di tripsina / EDTA incubare in incubatrice per 3 - 4 minuti. Controllare sotto un microscopio invertito per un corretto distacco delle cellule.
   1. Inattivare tripsina con l'aggiunta di 1 ml di TS media. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e centrifugare per 3 min a 200 x g. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 2 ml di TS media. Utilizzare il campione di controllo non trasdotte per contare le cellule.
   2. Piastra 4F-MEF, mCherry-MEF e MEF di controllo non trasdotte ciascuno ad una densità di 2 x 10 ⁵cellule per ogni 100 mm piatto di coltura cellulare in 10 ml TS mezzo contenente 2 mg / ml DOX (media TS + FGF4 / eparina + dox).
   3. In alternativa, eseguire transdifferenziazione su piatti più piccoli. Tavola 3.6 x 10 ³ cellule per cm ² sulle dimensioni piatto desiderato, il volume scala di conseguenza.
2. Il giorno successivo, usando un microscopio a epifluorescenza (utilizzando un obiettivo 10X e un filtro per fluorescenza rossa eccitazione) monitorare l'espressione di proteine ​​mCherry per valutare l'efficienza di trasduzione.
   Nota: l'efficienza di trasduzione dovrebbe essere prossimo al 100%. Se aumento della morte cellulare è evidente dopo l'induzione del transgene questo significa che il virus titolo era troppo alto. Trasduzione deve essere ripetuto con ridotta quantità di mezzo contenente il virus.
3. D'ora in poi il cambiamento media su tutti i piatti a giorni alterni fino al giorno 10 dopo la placcatura. Successivamente, nutrire le cellule con mezzo di TS senza DOX (media TS + FGF4 / eparina).
4. L'utilizzo di un monitor microscopio invertito percomparsa di 'transdifferentiated zone' (fare riferimento alla figura 2B e C) sul piatto 4F per un massimo di 3 settimane. Tali colonie non dovrebbero essere visibili sui due piatti di controllo (mCherry-MEF ei MEF non trasdotte).

6. L'isolamento di singoli ITSC Lines

Nota: Per il passaggio 6.3 non è richiesta una cappa coltura di tessuti. Si raccomanda di pulire il microscopio invertito con il 70% di etanolo per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione batterica. colonie individuali ITSC possono essere isolati tra i giorni 21 e 28 giorni di transdifferenziamento.

1. Aggiungere 40 ml di soluzione di tripsina / EDTA 0,05% in 12 pozzetti di una ben piatto 96 U-fondo e mettere il piatto sul ghiaccio.
2. Prima di isolamento delle colonie, media aspirare a 4F-MEF piatto transdifferenziamento. Lavare le cellule una volta con 10 ml di PBS. Anche in questo caso, aggiungere 10 ml di PBS e posto piatto sotto un microscopio invertito.
3. Usando una pipetta da 100 ml insieme a 40 ml sollevamento singolo colonie, dalla cli ircling con la punta della pipetta ed aspirando la colonia galleggiante. Trasferire le cellule di una colonia ciascuno in un pozzetto del preparato a 96 pozzetti piatto. Dopo aver raccolto 12 colonie pongono 96 pozzetti piatto in incubatore a 37 ° C per 5 min.
4. Dissociare cellule pipettando su e giù per diverse volte e sospensione cellulare trasferimento in un pozzetto di un piatto 24 pozzetti con preparati 500 ml di mezzo TS-CM (30% fresco TS media + 70% CM + FGF4 / eparina).
5. Il giorno seguente sostituire media con media TS-CM fresca per rimuovere le cellule morte. Cambiare mezzo di ogni altro giorno.
6. Monitor per l'aspetto delle colonie epiteliali con contorni luminosi (vedi figura 2). Una volta appaiono le colonie, la cultura fino al 70% confluenti o per un massimo di una settimana e gradualmente espandere su piatti di grandi dimensioni. D'ora in poi, le cellule cultura come in buona fede TSC, secondo protocolli standard nei media siero contenente o nei mezzi, definiti privi di siero ^3,5,11.

Risultati

Sul piatto dove viene attivato espressione del transgene della 4F, cellule cambiano rapidamente morfologia (confrontare Figura 2A e B). Intorno giorno 14 - 21 aree distinte transdifferentiated emergono (due esempi sono riportati nella figura 2B e C). Queste colonie primarie mancano morfologia tipica TSC; tuttavia una volta che sono sub-coltura, morfologia caratteristica epiteliale con bordi stretti e confini luminosi ricorda molto da vicino TSC in buona ...

Discussione

Il 4 fattore (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) protocollo transdifferenziazione basato qui presentata offre un metodo affidabile per generare fedelmente convertito iTSCs da fibroblasti embrionali di topo. Inoltre, il metodo è applicabile anche per i fibroblasti coda post-natale, anche se con un calo di efficienza rispetto ai fibroblasti embrionali ^3. In generale, la qualità dei fibroblasti primari è un fattore critico di esito transdifferenziazione e occorre prestare attenzione a utilizzare le cellule di passaggio...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Doxiciclina iclilato	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Sciogliere in PBS sterile, preparare 2 mg/ml di soluzione madre. Conservare le aliquote a -20 ° C
Clorochina difosfato sale	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Preparare 25 mM di soluzione madre in acqua sterile per colture cellulari. Conservare le aliquote a -20 ° C
Polibrene (bromuro di esadimetrina)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Preparare una soluzione madre da 8 mg/ml in acqua sterile per colture cellulari. Conservare le aliquote a -20 ° C
fattore di crescita dei fibroblasti ricombinanti umani 4	ReliaTech	300-131L	Sciogliere in sterile 0,1% BSA in PBS, preparare 25 &; g/ml di soluzione madre. Conservare le aliquote a -80 ° C
Eparina sale sodico	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendola in PBS sterile. Conservare le aliquote a -80 gradi C
ProFection Sistema di trasfezione per mammiferi	Promega	E1200
PBS, senza calcio, senza magnesio	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, senza glutammina	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P4707
Siero fetale bovino	Hyclone	SH30071.03IR
Filtro a membrana in acetato di cellulosa senza tensioattivi	Corning	431220
Aminoacidi	non essenzialiThermoFisher Scientific	11140-035
Penicillina Streptomicina	ThermoFisher Scientific	15140-122
Piruvato di sodio	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutammina	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-mercaptoetanolo	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimetilsolfossido (DMSO), grado per colture cellulari	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Topi B6. Cg-GT(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129