Qui presentiamo un protocollo per la conversione diretta di fibroblasti embrionali murini in cellule staminali del trofoblasto completamente funzionali e stabili mediante sovraespressione di dieci giorni di Tfap2c, Gata3, Eomes ed Ets2.
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Articolo metodologico
Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali
In questo articolo
Sommario
Abstract
cellule staminali Trophoblast (TSC) sono una conseguenza della prima decisione destino cellulare in sviluppo dei mammiferi. Essi possono essere coltivate in vitro, mantenendo la capacità di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in tutti i sottotipi del lineage trofoblasto, equivalenti in vivo staminali popolazione cellulare dando luogo alla parte fetale della placenta. Pertanto, TSC offrono un modello unico per studiare lo sviluppo placentare ed embrionale rispetto a extra-embrionali decisione destino della cellula in vitro. Dal stadio di blastocisti in poi, una barriera epigenetica distinta composto da metilazione del DNA e degli istoni modifiche separa ermeticamente entrambe le linee. Qui, descriviamo un protocollo per superare questa barriera completamente lignaggio da transitori sovra-espressione del trofoblasto regolatori chiave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 in fibroblasti embrionali murini. Le cellule staminali del trofoblasto indotte sono in grado di auto-rinnovarsi e sono quasi identiche a blastocisti di cellule staminali derivate trofoblasto in termini di morfologia, l'espressione del gene marcatore e modello di metilazione. Funzionale in vitro e in vivo confermano che queste cellule sono in grado di differenziarsi lungo lignaggio trofoblasto generare cellule giganti poliploide trofoblasto e chimerizing la placenta quando iniettato in blastocisti. L'induzione di cellule staminali dal tessuto trofoblasto somatica apre nuove strade per studiare le caratteristiche genetiche ed epigenetiche di questo lignaggio extra-embrionale e offre la possibilità di generare linee di cellule staminali trofoblasto senza distruggere l'embrione rispettivo.
Introduzione
Recentemente, uno studio di confronto diversi approcci di topo cellule staminali embrionali di trofoblasto conversione delle cellule staminali ha rivelato che in tutti i sistemi analizzati, la conversione lignaggio è rimasto incompleto. Invece di cellule staminali indotte (trofoblasto) iTSCs cosiddette staminali trofoblasto cellule simili alle cellule sono stati generati conservando un ricordo del destino delle cellule di origine 1. Qui, abbiamo seguito un approccio diverso di generazione ITSC. Simile a l'induzione diretta di cellule staminali pluripotenti da murine fibroblasti embrionali (MEF) 2, iTSCs sono stati convertiti direttamente dal....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti di topo sono stati condotti secondo la legge tedesca di protezione degli animali e in accordo con l'approvazione dei comitati per la cura degli animali istituzionali locali (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nord Reno-Westfalia [numero ID di approvazione: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Carta Preparazione
- Preparare 293T media: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) di FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato di sodio (1 mM), penicillina / streptomicina (1x).
- Preparare medio MEF: DMEM, 10% (v / v) di FBS, L-glutamina (2 mM), aminoacidi non essenziali 1x, penicillina / st....
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Risultati
Sul piatto dove viene attivato espressione del transgene della 4F, cellule cambiano rapidamente morfologia (confrontare Figura 2A e B). Intorno giorno 14 - 21 aree distinte transdifferentiated emergono (due esempi sono riportati nella figura 2B e C). Queste colonie primarie mancano morfologia tipica TSC; tuttavia una volta che sono sub-coltura, morfologia caratteristica epiteliale con bordi stretti e confini luminosi ricorda molto da vicino TSC in buona .......
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Discussione
Il 4 fattore (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) protocollo transdifferenziazione basato qui presentata offre un metodo affidabile per generare fedelmente convertito iTSCs da fibroblasti embrionali di topo. Inoltre, il metodo è applicabile anche per i fibroblasti coda post-natale, anche se con un calo di efficienza rispetto ai fibroblasti embrionali 3. In generale, la qualità dei fibroblasti primari è un fattore critico di esito transdifferenziazione e occorre prestare attenzione a utilizzare le cellule di passaggio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Doxiciclina iclilato | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Sciogliere in PBS sterile, preparare 2 mg/ml di soluzione madre. Conservare le aliquote a -20 ° C |
| Clorochina difosfato sale | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Preparare 25 mM di soluzione madre in acqua sterile per colture cellulari. Conservare le aliquote a -20 ° C |
| Polibrene (bromuro di esadimetrina) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Preparare una soluzione madre da 8 mg/ml in acqua sterile per colture cellulari. Conservare le aliquote a -20 ° C |
| fattore di crescita dei fibroblasti ricombinanti umani 4 | ReliaTech | 300-131L | Sciogliere in sterile 0,1% BSA in PBS, preparare 25 &; g/ml di soluzione madre. Conservare le aliquote a -80 ° C |
| Eparina sale sodico | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendola in PBS sterile. Conservare le aliquote a -80 gradi C |
| ProFection Sistema di trasfezione per mammiferi | Promega | E1200 | |
| PBS, senza calcio, senza magnesio | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, senza glutammina | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Filtro a membrana in acetato di cellulosa senza tensioattivi | Corning | 431220 | |
| Aminoacidi | non essenzialiThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillina Streptomicina | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Piruvato di sodio | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutammina | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-mercaptoetanolo | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimetilsolfossido (DMSO), grado per colture cellulari | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Topi B6. Cg-GT(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
Riferimenti
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....
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Ristampe e permessi
