Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Michael G. Daniel; Carlos-Filipe Pereira; Jeffrey M. Bernitz; Ihor R. Lemischka; Kateri Moore

doi:10.3791/54372

Articolo metodologico

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

6.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54372

⸱

16 dicembre 2016

Michael G. Daniel¹^,²^,³ , Carlos-Filipe Pereira⁴ , Jeffrey M. Bernitz¹^,²^,³ , Ihor R. Lemischka¹^,³^,⁵ , Kateri Moore¹^,³

¹Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ³Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ⁴Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, ⁵Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Abstract

Questo protocollo descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo (MEF) tramite sovraespressione di fattori di trascrizione (TF). Per prima cosa abbiamo progettato uno screening reporter utilizzando MEF di topi transgenici doppi CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP). Le cellule CD34⁺ di questi topi marcano gli istoni H2B con GFP e cessano la marcatura dopo l'aggiunta di doxiciclina (DOX). Le MEFS sono state trasdotte con TF candidati e quindi osservate per l'emergere di cellule GFP⁺ che indicherebbero l'acquisizione di un destino cellulare ematopoietico o endoteliale. Partendo da 18 TF candidati, e attraverso un processo di eliminazione combinatoria, abbiamo ottenuto un insieme minimo di fattori che inducerebbero la più alta percentuale di cellule GFP⁺. Abbiamo scoperto che Gata2, Gfi1b e cFos erano necessari e l'aggiunta di Etv6 ha fornito l'induzione ottimale. Una serie di analisi dell'espressione genica eseguite in diversi momenti durante il processo di riprogrammazione ha rivelato che queste cellule sembravano passare attraverso una cellula precursore che ha subito una transizione da endoteliale a ematopoietica (EHT). In quanto tale, questo processo di riprogrammazione imita l'emopoiesi dello sviluppo "in un piatto", consentendo lo studio dell'emopoiesi in vitro e una piattaforma per identificare i meccanismi che sono alla base di questa specificazione. Questa metodologia fornisce anche un quadro per la traduzione di questo lavoro nel sistema umano nella speranza di generare una fonte alternativa di cellule staminali ematopoietiche (HSC) paziente-specifiche per una serie di applicazioni nel trattamento e nello studio delle malattie ematologiche.

Introduzione

Emopoiesi è un processo di sviluppo complesso in cui le cellule staminali ematopoietiche (CSE) germogliano fuori endotelio hemogenic presente in una varietà di siti emopoietiche embrionali, come l'aorta-gonadi-Mesonefro e la placenta ^1,2. L'incapacità di coltura in vitro CSE impedisce approfondita analisi di questo processo così come l'applicazione clinica di questi studi. Per aggirare questa limitazione, studi precedenti hanno tentato di derivare cellule staminali emopoietiche de novo sia attraverso la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti (PSC) ^3, o la plasticità indotta nelle cellule somatiche e l....