Utilizzando i tumori derivati da pazienti in un modello preclinico per via sottocutanea è un ottimo modo per studiare l'efficacia di nuove terapie, scoperta di biomarcatori predittivi, e percorsi resistenti ai farmaci. Questo modello, nel processo di sviluppo di un farmaco, è essenziale nel determinare il destino di molte nuove terapie anti-cancro prima indagine clinica.
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Articolo metodologico
Sviluppo e manutenzione di un tumore del paziente preclinici Derivato dello xenotrapianto modello per il Controllo delle Novel Anti-Cancer Therapies
In questo articolo
Sommario
Abstract
I modelli di xenotrapianto tumorale derivato da pazienti (PDTX) forniscono una piattaforma necessaria per facilitare lo sviluppo di farmaci antitumorali prima degli studi sull'uomo. Pezzi di tumore umano vengono iniettati per via sottocutanea in topi nudi atimici (immunocompromessi, carenti di cellule T) per creare una banca di tumori e successivamente vengono fatti passare in diverse generazioni di topi al fine di mantenere questi tumori dai pazienti. È importante sottolineare che l'eterogeneità cellulare del tumore originale è strettamente emulata in questo modello, che fornisce un modello clinicamente più rilevante per la valutazione degli studi di efficacia dei farmaci (singolo agente e combinazione), l'analisi dei biomarcatori, le vie di resistenza e la biologia delle cellule staminali tumorali. Alcune limitazioni del modello PDTX includono la sostituzione dello stroma umano con lo stroma di topo dopo la prima generazione nei topi, l'incapacità di studiare gli effetti del trattamento sulle metastasi a causa delle iniezioni sottocutanee dei tumori e la mancanza di valutazione delle immunoterapie a causa dell'uso di topi immunocompromessi. Tuttavia, anche con queste limitazioni, il modello PDTX fornisce una potente piattaforma preclinica nel processo di scoperta dei farmaci.
Introduzione
Il cancro colorettale (CRC) è un contributo significativo ai decessi per cancro negli Stati Uniti. Nel 2015, sono stati stimati 132.700 nuovi casi di CRC con 49,700 morti 1. Anche se la prognosi nei pazienti con malattia localizzata è eccellente, i pazienti con malattia avanzata hanno scarsi risultati, rendendo questo una delle principali priorità nello sviluppo di nuove terapie. Nonostante livello di regimi di cura chemioterapici e biologici più recenti che vengono distribuite contro questa malattia, c'è stato solo un aumento incrementale della sopravvivenza globale. Di conseguenza, vi è un notevole sforzo nella comprensione delle vie pilota coinvolto nel facilitare la crescita tumorale in questa malattia. L'Atlante rete Cancer Genome ha recentemente identificato numerosi sentieri principali che sono implicati nella disregolazione CRC e comprendono: WNT, phosphoinositide 3-chinasi (PI3K), RAS, fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) e TP53 2. Insieme, con le indagini che descrivono oti suoi percorsi che potenziano la crescita in CRC hanno acceso lo sviluppo di nuove terapie volte a migliorare in modo significativo la sopravvivenza in questa popolazione di pazienti 3-5. Utilizzando modelli preclinici di sviluppo di farmaci oncologici sono stati fondamentali in questo processo nel predire l'attività clinica di questi nuovi composti.
Vari modelli preclinici sono stati utilizzati nel processo di sviluppo dei farmaci. Considerando che i modelli animali transgenici preclinici e immortalati linee cellulari non hanno avuto successo nel determinare l'attività clinica di nuove terapie oncologiche, in gran parte a causa della loro incapacità di riflettere la complessità dei tumori umani, sono stati stabiliti i modelli paziente di derivazione tumorale xenotrapianto (PDTX). Il grande vantaggio di questo modello è che l'eterogeneità del tumore rimane intatto e rispecchia da vicino le caratteristiche molecolari e clonalità della originario del tumore del paziente 6-9. Modelli PDTX forniscono un eccellente in vivopiattaforma preclinico per studiare nuovi agenti, percorsi di resistenza ai farmaci, strategie combinatori e biologia delle cellule staminali del cancro 10.
Una panoramica generale del processo PDTX è illustrato in Figura 1. Inizia nella clinica, pazienti consenzienti permettere alcune loro tessuto tumorale in eccesso da utilizzare per questa ricerca. Poi, a un intervento chirurgico, un pezzo del tumore viene incassato da un patologo e messo in media per essere trasportati al personale di ricerca. Subito dopo, una sezione del tumore viene tagliato in piccoli pezzi e trapiantato in topi immunodeficienti sottocutanea. Una volta che il tumore cresce, si diversi passaggi in diverse generazioni di topi per mantenere il tumore 10. Tipicamente, dopo la generazione F3 il tumore può essere espansa in uno studio di trattamento in cui vengono valutate nuovi composti e / o terapie combinatorie. Utilizzando Next Gen Seq (exome Seq, RNA-Seq e SNP array) potenziali biomarcatori predittivi sono scoprireEd che assistono nella selezione dei pazienti che possono trarre benefici da un particolare trattamento.
Gli obiettivi generali di utilizzo di modelli PDTX sono: 1) valutare l'efficacia di nuove terapie come monoterapia o in combinazione e 2) identificare biomarcatori predittivi di sensibilità o di resistenza prima indagine clinica. In questo manoscritto, mettiamo a disposizione la metodologia l'avvio e il mantenimento di una banca CRC PDTX e fornire i vantaggi ei limiti di questo modello nella scoperta lo sviluppo di farmaci.
Figura 1. Panoramica del CRC PDTX modello di protocollo. Un tumore derivato paziente viene ricevuto da un intervento chirurgico e subito iniettato in topi nudi atimici per via sottocutanea. Una volta che il tumore cresce si espande in generazioni successive e, infine, ampliato per studi di trattamento. RESPO trattamentons vengono valutati e biomarcatori predittivi vengono identificati che possono aiutare nella selezione dei pazienti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocollo
Etica Dichiarazione: campioni tumorali del colon adenocarcinoma derivati da pazienti sono stati ottenuti da pazienti consenzienti presso la University of Colorado Hospital di secondo un protocollo approvato dalla multipla Institutional Review Board Colorado (08-0439). Tutto il lavoro animale è stato eseguito secondo protocolli animali approvati dalla University of Colorado Denver Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC, protocollo # 51412 (06) 1E e 96813 (04) 1E).
1. Ricezione e Preparazione sangue del paziente
- Raccogliere 1 - 2 ml di sangue in una provetta di separazione del sangue / cella contenente citrato di sodio (fasi tubi inclusi sono plasma, linfociti e monociti banda, fluido gradiente di densità, la barriera di gel, e eritrociti e neutrofili). Attenzione, seguire le linee guida Bloodborne agenti patogeni con sangue o tessuti.
Nota: PBMC e plasma potrebbero essere utilizzati per gli studi futuri che possono includere: confrontando la variazione genetica germinale mutazioni tumorali, isolando circulacellule tumorali Ting, valutando il DNA cellulare libero (cfDNA), proteine esame e microRNA, ecc. - Centrifugare il tubo di separazione / cellule del sangue a 2.500 xg per 15 min senza freno a temperatura ambiente.
- Raccogliere le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC in linfociti e banda monociti del tubo) e messo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga (trasparente, autoclavabile, DNasi, RNasi, e apirogena), e riempire la parte superiore del tubo con sterile tamponata al fosfato Saline (PBS).
- Centrifugare a 2300 xg per 3 min a RT per formare un pellet di PBMC sul fondo della provetta. Quindi, rimuovere con attenzione il surnatante. Aggiungere 1 ml di PBS sterile per lavare il pellet e centrifugare a 3000 xg per 30 secondi e quindi rimuovere surnatante.
- Utilizzare una pipetta per raccogliere il plasma dalla provetta separazione del sangue / cellule (in fase di plasma di tubo) in un flaconcino criogenico 1,5 ml sterile (DNasi e RNasi libero, nessun DNA umano, endotossine libero) e mettere il plasma e pellet di PMBC di in un -80 ° C freezer per la conservazione.
2. Ricezione e preparazione del paziente campione di tumore
- Preparare sia RPMI o DMEM media con 1: 100 (10%) di penicillina-streptomicina e non essenziali aminoacidi, 1: 1000 (1%) Plasmocin, e il 10% inattivato siero fetale bovino (completo dei media) e aggiungere 20 - 25 ml ad una tazza di raccolta sterile per il campione tumorali.
- Recupera campione di tumore in una tazza sterile contenente completa media su ghiaccio o mantenere a 4 ° C.
Nota: Il campione di tumore è un pezzo di tessuto in eccesso tumorale paziente che viene rimosso da un chirurgo, elaborato da un patologo, e inserito in una tazza di raccolta sterile con completo supporto. Attenzione, seguire le linee guida Bloodborne agenti patogeni con sangue o tessuti. Inoltre, idealmente per iniettare cinque topi, il tumore dovrebbe essere di circa 1 cm³. - Portare il campione del tumore al stabulario per iniettare in topi immunocompromessi.
Nota: Si consiglia di elaborare il campione di tumore più presto possibile.- In una cappa a flusso laminare, posizionare il campione tumorale in un piatto di taglio di plastica sterile dalla tazza tumore. Utilizzare autoclave-piccole forbici e pinze per tagliare in 10 - 12 pezzi di circa 3 x 3 x 3 mm e posto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga autoclave riempita con 300 ml di soluzione di miscela proteica gelatinosa. Mantenere il tubo in ghiaccio.
- Come priorità iniettare del tumore nei topi, ma se non vi è alcun tumore sinistra sopra, raccogliere il flash congelato fiale (FF) tazze, fissati in formalina paraffina (FFPE), e una fiala di tumore vitale.
- Per FF, raccogliere piccoli pezzi di tessuti tumorali da una fiala criogenico sterile per ulteriori analisi, quali proteine, RNA, o l'isolamento del DNA. Posizionare FF immediatamente in un dewar di azoto liquido e conservare a lungo termine in un -80 ° C freezer.
- Per FFPE, se c'è abbastanza tumore, posto 3 piccoli pezzi in una tazza formalina 10 ml 10% e processo in blocchi incorporati paraffina volta tumore è stato in formalina per almeno 24 ore.
Nota: 24 ore si basafuori i nostri suggerimenti Istologia fondamentali 11. - Infine, posizionare il tumore rimanente in un tubo criogenico. Fare supporti vitali con l'aggiunta del 10% dimetilsolfossido (DMSO) per completare i media. Successivamente, aggiungere 1 ml in una provetta criogenica e memorizzare sul ghiaccio. Nota: non tenere in ghiaccio per lunghi periodi di tempo.
- Tagliare qualsiasi tumore residuo in piccoli pezzi che idealmente sarà sufficiente per 10 tumori da iniettare in 5 topi in futuro. Poi, posizionare il tubo tumorali vitali in ghiaccio fino può essere collocato in un contenitore di congelamento alcol isopropilico (congela lentamente tumore 1 ° C alla volta) e messo in freezer -80 ° C per assicurare che i tumori non muoiono durante la processo di congelamento.
Nota: Per la conservazione a lungo termine dei tumori vengono rimossi (dopo 2 - 3 giorni) e inseriti in un grande dewar di azoto liquido. Si prega di notare che i tubi vitali non dovrebbe essere permesso di scongelare a meno che non viene portato fuori per iniettare in topi.
- Tagliare qualsiasi tumore residuo in piccoli pezzi che idealmente sarà sufficiente per 10 tumori da iniettare in 5 topi in futuro. Poi, posizionare il tubo tumorali vitali in ghiaccio fino può essere collocato in un contenitore di congelamento alcol isopropilico (congela lentamente tumore 1 ° C alla volta) e messo in freezer -80 ° C per assicurare che i tumori non muoiono durante la processo di congelamento.
3.L'iniezione di paziente Derivato xenotrapianti tumorali
- Utilizzare cinque 6-8 settimane di età di sesso maschile e / o femminile topi nudi atimici (cellule T carente) per ogni paziente separata tumore derivato. Iniettare un totale di 10 tumori (2 iniezioni al mouse) per via sottocutanea (SQ).
Nota: Il tumore umano originario è designato come F0 e poi una volta iniettato in topi la prossima generazione è F1. Inoltre, utilizzare pinze in autoclave, forbici e trocar per ogni espianto unico. - pezzi di carico del tumore dalla soluzione miscela proteica gelatinosa in autoclave 12 trocar G e assicurarsi che il tumore è completamente spinto nella trequarti.
- In una cappa a flusso laminare sterile, collocare 5 topi in una scatola anestesia che è collegato ad una macchina isoflurano anestesia (iniziata alla velocità iniziale di 5% isoflurano, 3 - 4% di ossigeno, e 2 - 3% isoflurano per il mantenimento dell'anestesia) e filtro al carbone (assorbe gas in eccesso).
Nota: Un tecnico esperto dovrebbe essere in grado di eseguire l'intera procedura suiuna gabbia di 5 topi entro circa 5 minuti in totale (circa 30 sec per il mouse). Pertanto ulteriore supporto termico e lubrificazione occhio non è generalmente utilizzato. Per gli individui meno esperti o durante l'allenamento, si raccomanda che gli individui o eseguire la procedura con meno animali in una sola volta e / o utilizzare un riscaldamento di lubrificazione pad / occhio durante la procedura se gli animali saranno anestetizzati più di 5 min. Procedura si basa su standard IACUC presso la nostra università.
- In una cappa a flusso laminare sterile, collocare 5 topi in una scatola anestesia che è collegato ad una macchina isoflurano anestesia (iniziata alla velocità iniziale di 5% isoflurano, 3 - 4% di ossigeno, e 2 - 3% isoflurano per il mantenimento dell'anestesia) e filtro al carbone (assorbe gas in eccesso).
- Pinch un dito del piede del mouse per assicurare il mouse non è più reattivo, poi prendere il mouse fuori dalla scatola isoflurano. Posizionare il mouse su un campo pulito per iniettare i tumori sulla regione del collo dorsale centrale e trascinando il trequarti verso il basso per via sottocutanea fino a quando la regione del fianco si raggiunge con autoclave 12 trequarti G.
- Invia sottocutanea un tumore per ciascun lato del fianco del topo. Pinch il tumore quando il trequarti viene tirato fuori, assicurando che il tumore rimane nella regione del fianco desiderato. la gemiscela proteica latinous indurisce con la temperatura del corpo del mouse e incapsula il tumore per circa 1 settimana per aiutare il tumore crescere e fissarlo al tessuto connettivo SQ. La lesione fatta dalla trequarti non superiore a 4 mm e non vi è alcuna necessità di chiudere la pelle con punti metallici.
Nota: I nostri veterinari determinato nessuna chiusura è necessario in base molto piccole dimensioni della lesione, tempo di guarigione rapida (regione del collo dorsale centrale riduce qualsiasi tensione della pelle o toelettatura di lesione), non infezioni noti, e l'attento controllo degli animali durante questo periodo di tempo .
- Invia sottocutanea un tumore per ciascun lato del fianco del topo. Pinch il tumore quando il trequarti viene tirato fuori, assicurando che il tumore rimane nella regione del fianco desiderato. la gemiscela proteica latinous indurisce con la temperatura del corpo del mouse e incapsula il tumore per circa 1 settimana per aiutare il tumore crescere e fissarlo al tessuto connettivo SQ. La lesione fatta dalla trequarti non superiore a 4 mm e non vi è alcuna necessità di chiudere la pelle con punti metallici.
- Prima che il mouse è completamente sveglio iniettare Meloxicam 2 mg / kg SQ (farmaci per il dolore) di distanza dal sito di iniezione del tumore. Successivamente, posizionare il mouse nella gabbia e monitorare fino a quando il mouse è sveglio e in movimento.
Nota: non lasciare il recupero di animali incustoditi fino completamente sveglio. dosaggio Meloxicam è basata su standard IACUC presso la nostra università.- Avanti, ripetere la stessa procedura con la 4restante topi e monitorare il loro respiro.
Nota: Si prega di notare che questo è un molto veloce procedura e topi svegliarsi molto presto dopo l'iniezione Meloxicam, ma regolare isoflurano, se necessario. Ogni volta che il mouse viene portato fuori, abbassare il isoflurano. Il Meloxicam durerà 24 ore e le lesioni dei trequarti sarà completamente guarire in 1 settimana.
- Avanti, ripetere la stessa procedura con la 4restante topi e monitorare il loro respiro.
4. Manutenzione del paziente Derivato tumore Xenotrapianto Bank
- Monitorare la crescita e la salute dei topi almeno una volta alla settimana. Utilizzare un foglio di calcolo (o altro sistema di monitoraggio) per monitorare la dimensione del tumore, la generazione del tumore, la data di iniezione del tumore, e la salute dei topi.
Nota: Se i topi hanno perso il 15% del loro peso corporeo iniziale, punteggi condizione corporea basso (≥ 2), hanno ulcerazioni tumorali, tumori raggiungendo 2.000 millimetri 3 o tumori totali 3.000 millimetri 3, o sono malaticcio (curvo, freddo, letargia, ecc .) in qualsiasi modo, i topi sono eutanasia tramite CO₂ o anestetizzato seguita da dislocazione cervicale comeMetodo econdary. Euthanize tramite anestesia e dislocazione cervicale se la raccolta del tumore, in caso contrario i topi sono eutanasia tramite CO₂ e dislocazione cervicale. - Quando un tumore è di circa 1.500-2.000 mm 3 anestetizzare i topi come descritto sopra e quindi eseguire dislocazione cervicale a eutanasia.
- Verificare che il mouse non ha battito cardiaco. Asportare il tumore SQ con le forbici e pinze in autoclave.
NOTA: Lasciare i tumori a crescere fino a 1 anno e se nessun tumore si vede quindi euthanize i topi via di CO 2, seguita da dislocazione cervicale come metodo secondario. - Passaggio al meglio tumore cresce nella prossima generazione (aka una nuova serie di 5 topi). Istruzioni per l'uso sopra per raccogliere 10 - 12 tumori per il passaggio e poi raccolgono il tumore residuo, come anche descritto in precedenza.
Nota: Raccolta numerosi tubi vitali è molto importante nelle prime generazioni (F1 - F8); quindi raccogliere diversi tubi, tubi vitali FF e 1 FFPE per generationico. - Mantenere i topi rimanenti fino ad una nuova generazione di topi ha una crescita tumorale di circa 300 mm 3. Quando i topi rimanenti hanno tumori che sono grandi, continuare a raccogliere come descritto sopra.
- Verificare che il mouse non ha battito cardiaco. Asportare il tumore SQ con le forbici e pinze in autoclave.
- Continuare a tumori di passaggio e raccogliere in ogni fase fino a F15. A questo punto, prendere un tubo praticabile della prima generazione possibile fuori azoto liquido e lasciare scongelare su ghiaccio e seguire le procedure tumore-iniezione sopra descritti.
Nota: I tumori che crescono da tubi vitali richiedono più tempo per crescere nei topi rispetto a passare di generazione in generazione, in modo da tenere a mente quando si pianifica. Se un particolare modello di PDTX non è più necessaria in ogni passaggio, eutanasia e raccogliere tumore, al fine di garantire numerosi tubi vitali sono raccolti per un utilizzo futuro.
5. Developmental Therapeutics con il paziente Derivato xenotrapianti tumorali
Nota: La maggior parte dei tumori al generazione F3 hanno buone cinetica di crescita (crescono più velocemente e più consistent), quindi, procedere alla PDTX studi di efficacia dei farmaci.
- Quando il tumore desiderato è molto grande (1.500 - 2.000 mm 3), seguire le procedure di cui sopra per la raccolta del tumore di espandersi in quantità desiderata di topi.
- A seconda ipotesi in prova determinare il numero di tumori necessari per gruppo di trattamento.
Nota: 1 ml di soluzione di miscela proteica gelatinosa può approssimativamente misura 30 piccoli pezzi tumorali (seconda morfologia tumorale) per iniettare in topi.
- A seconda ipotesi in prova determinare il numero di tumori necessari per gruppo di trattamento.
- Controllare i topi con tumori settimanali e quando la maggior parte dei tumori sono visibilmente piccole (circa tra 50-300 mm ³) misurare i tumori con pinze per determinare il volume del tumore. volume del tumore = [width² (valore più basso) di lunghezza x (il più grande misura)] x 0,52.
Nota: La soluzione miscela proteica gelatinosa circonda i pezzi tumore iniettati per una settimana, poi, dopo una settimana crescita tumorale sarà accurato. - Utilizzare i volumi del tumore tra 50 - 300 mm³ e lan media del tumore sinistro e destro. Poi randomizzare in gruppi di trattamento con 10 tumori per gruppo e in media gruppo entro alcuni numeri uno dall'altro. Avanti, ordinare i topi in gruppi e iniziare lo studio trattamento desiderato.
- Dosare i topi con la droga (programma dipendente dalla droga), pesare e misurare (tumore) due volte a settimana. Alla fine dello studio, i topi eutanasia tramite anestesia e dislocazione cervicale e raccogliere tumore per il futuro l'analisi farmacodinamica in laboratorio.
Nota: Lo studio dura 30 giorni a seconda della dimensione del tumore veicolo e la salute dei topi.
6. Organizzazione di una banca PDTX
- Mantenere una forma ben documentata per evitare di ripetere la ricerca e l'uso appropriato degli animali.
NOTA: Questa è la chiave per una banca PDTX successo.- Utilizzare i fogli di calcolo per tenere traccia di un tumore dal paziente umano in clinica, a topi in banca PDTX, trattamenti, i dati, e ciò che viene raccolto. Nota: questo include congelatore, dewar di azoto liquidoE stoccaggio FFPE pure.
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Risultati
Somiglianze di mutazioni comuni nei modelli CRC PDTX e la TCGA
Abbiamo studiato se la percentuale di mutazioni comuni (KRAS, le ANR, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 e TP53) nella banca CRC PDTX erano rappresentante per la frequenza di mutazione visto nella popolazione di pazienti CRC. Come mostrato nella Figura 2A (TCGA) e B (CRC banca PDTX), la frequenza di mutazioni in qu...
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Discussione
La piattaforma di scoperta di nuovi farmaci PDTX offre un modello migliorato per le carenze di altri modelli preclinici che sono inaffidabili nel predire attività clinica di nuovi composti. È importante sottolineare che i tumori in questo modello sono biologicamente stabile, mantenere potenziale metastatico, e mostrano simili reattività di droga di generazione in generazione. In questo modello, i tumori paziente derivato vengono iniettate in topi nudi atimici, diversi passaggi, e successivamente utilizzati nella valutaz...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione 1R01CA152303-01.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI o DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillina-Streptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| Aminoacidi non essenziali | Corning | 25-025-CI | |
| Siero fetale bovino | Corning | 35-010-CV | Scongelamento in -4 gradi C, quindi attivare per 30 minuti a 60 ° C bagnomaria |
| CPT provetta per sangue | BD vacutainer | 362761 | |
| Provetta per microcentrifuga | Surelock | A-7002 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Corning | 21-040-CV | |
| Fiale | cyrogenic Cyroking | C0732901 | |
| Piatto di taglio tumorale in plastica | Trueline | TR4001 | |
| Forbici | Roboz | Pinze RS-5881 | |
| Roboz | RS-5135 | ||
| Matrigel (miscela di proteine gelatinose) | Corning | 354234 | Conservare a -20 o -80 ° C, quindi scongelare con ghiaccio, non lasciare a RT |
| 10% Tazze di formalina | Protocollo | 032-059 | |
| Azoto liquido Dewar | Stoccaggio Thermolyne | CY50900 | |
| Azoto liquido portatile Dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimetil solfossido | Fischer | 67-68-5 | |
| Contenitore di congelamento: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Alcool isopropilico | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Ricerca innovativa dell'America | MP-182 | |
| Macchina per anestesia | Patterson Scatola | ||
| Patterson Veterinario | |||
| Isoflurane | Vet uno | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Pinze | Fowler | 54-100-167 | |
| Bilancia | Ohaus | Scout Pro SP601 |
Riferimenti
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