Questo articolo descrive la raccolta e l'elaborazione di campioni per l'analisi della citometria di massa.
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Articolo metodologico
Preparazione del campione per l'analisi di massa Citometria
In questo articolo
Sommario
Abstract
Massa utilizza citometria anticorpi coniugati con le etichette di metalli pesanti, un approccio che ha notevolmente aumentato il numero di parametri e opportunità per l'analisi pozzo profondo di quanto sia possibile con i tradizionali flusso basato sulla fluorescenza citometria. Come per ogni nuova tecnologia, ci sono passaggi critici che aiutano a garantire la generazione affidabile di dati di alta qualità. Qui presentata è un protocollo ottimizzato che comprende molteplici tecniche per il trattamento di campioni di cellule per l'analisi di citometria di massa. I metodi descritti qui aiuterà l'utente a evitare problemi comuni e raggiungere risultati coerenti minimizzando variabilità, che può portare a dati accurati. Per informare disegno sperimentale, la logica alla base operazioni opzionali o alternative nel protocollo e la loro efficacia nello scoprire nuove scoperte nella biologia del sistema oggetto di indagine è coperto. Infine, i dati rappresentativi è presentato per illustrare i risultati attesi dalle tecniche Presented qui.
Introduzione
Citometria consente la misurazione simultanea di più target anticorpali a livello di singola cellula attraverso grandi popolazioni di cellule. Nel tradizionale citometria di flusso basato sulla fluorescenza, il numero di parametri che possono essere quantificate è limitato dalla sovrapposizione spettrale tra lo spettro di emissione dei fluorofori multipli, che richiede calcoli di compensazione sempre più complessi come il numero di parametri aumenta. Queste limitazioni sono rivolte in massa citometria, dove vengono rilevati e quantificati mediante tempo di volo (TOF) spettrometria di massa per espandere notevolmente il numero di parametri raccolti simultaneamente e p....
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Protocollo
1. cellule da raccolta
- Che raccolgono le cellule da tessuto primario
NOTA: Il procedimento descritto per le cellule raccolta da tessuto primario è specificamente applicabile al tessuto tumorale mammario mouse e non può essere applicato come ai tessuti primari da altre fonti.- Preparare tampone di digestione sciogliendo 5 mg e 30 mg ialuronidasi collagenasi in 10 ml DMEM / F12 supporti per grammo di tessuto da trattare. Filtrata sterilizzare tampone di digestione.
- Isolare primario del tumore della ghiandola mammaria di topo e registrare tumore peso.
- Tritare il tessuto con il # 10 bisturi per almeno 5 minut....
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Risultati
Il protocollo presentato qui può essere ampiamente applicata ad una vasta gamma di campioni di cellule in coltura e primario con modifiche solo minori. A seconda delle esigenze dell'esperimento, può essere eseguita in modo modulare quando alcuni elementi, come codici a barre o superficie cellulare colorazione, non sono necessarie. Utilizzato nella sua interezza questo protocollo consente la preparazione di massa multiplato citometria campioni etichettati per identificazione popolazione m.......
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Discussione
Il protocollo presentato qui è stato impiegato con successo per il trattamento di varie linee in coltura di cellule (H1 e H9 hESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) e campioni di tessuti primari (midollo osseo di topo, il mouse del fegato embrionale, il mouse per adulti fegato, tumore mouse). Indipendentemente dalla fonte, qualsiasi tessuto che può essere dissociato in singole cellule preservando lo stato cellulare dovrebbe essere suscettibile di analisi mediante citometria di massa, ma può richiedere alcuni ott.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro nel laboratorio Barton è stato supportato da una sovvenzione del Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). Questa ricerca è stata in parte supportata da una borsa di studio per la formazione per Ryan L. McCarthy dal National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. La struttura principale che mantiene e gestisce la macchina per citometria di massa è supportata dalla sovvenzione CPRIT (RP121010) e dalla sovvenzione centrale NIH (CA016672).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| mTeSR1 kit medio | Tecnologie delle cellule staminali | 05850 | Caldo a temperatura ambiente prima dell'uso |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Caldo a 37 ° C prima dell'uso |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Caldo a 37 ° C prima dell'uso |
| Albumina sierica bovina | Equitech | BAH62 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Fornito a 1 mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | fornito a 1 | |
| mM Cell ID Pt196 | Fluidigm | fornito a 1 mM | |
| Cisplatino | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Solubile a 25 mg/mL in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deossiuridina | Sigma-Aldrich | I7125 | solubile a 74 mg/mL in 0,2 N NaOH |
| Rodio 103 agente intercelante | Fluidigm | 201103A | |
| Metanolo | Fisher | BP1105-4 | Raffreddare a -20 ° C prima dell'uso |
| Sodio Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5 mL provette a fondo tondo | Falcon | 352058 | |
| 5 mL 35 μ m tubi con tappo del filtro | Falcon | 352235 | |
| EQ perle di calibrazione a quattro elementi | Fluidigm | 201078 | |
| Ialuronidasi Tipo I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Bisturi monouso #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
Riferimenti
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398(2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015....
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Ristampe e permessi
