Creazione di addominali aderenze nei topi

Sommario

Le aderenze addominali che si formano dopo l'intervento chirurgico sono una delle principali cause di dolore, infertilità, ospedalizzazione e reintervento per ostruzione dell'intestino tenue. La nostra procedura chirurgica per la creazione di aderenze addominali nei topi è uno strumento affidabile per studiare i meccanismi alla base della formazione delle aderenze.

Abstract

Le aderenze addominali consistono in tessuto fibrotico che si forma nello spazio peritoneale in risposta a un insulto infiammatorio, tipicamente un intervento chirurgico o un'infezione intraaddominale. I meccanismi precisi alla base della formazione dell'adesione sono poco conosciuti. Molti composti e barriere fisiche sono stati testati per la loro capacità di prevenire le aderenze dopo l'intervento chirurgico con vari livelli di successo. Il topo e il ratto sono modelli importanti per lo studio delle aderenze addominali. In letteratura esistono diverse tecniche per la creazione di aderenze nel topo e nel ratto. Qui descriviamo un protocollo che utilizza l'abrasione del cieco con carta vetrata e suture posizionate nella parete laterale addominale destra. Il topo viene anestetizzato e l'addome viene preparato. Viene creata una laparotomia della linea mediana e viene identificato il cieco. La carta vetrata viene utilizzata per abradere delicatamente la superficie del cieco. Successivamente, diverse suture a forma di otto vengono posizionate nel peritoneo della parete laterale addominale destra. La cavità addominale viene irrigata, viene applicata una piccola quantità di amido e l'incisione viene chiusa. Abbiamo scoperto che questa tecnica produce le aderenze più coerenti con il più basso tasso di mortalità.

Introduzione

aderenze addominali sono una forma di tessuto cicatriziale che si formano nell'addome in risposta all'infiammazione, di solito dopo un intervento chirurgico o infezioni intra-addominale. Le adesioni sono una delle principali cause di dolore addominale cronico ed infertilità, e sono la causa più comune di piccola occlusione intestinale ^1. La presenza di aderenze fa eseguire una seconda operazione addominale più difficile e aumenta la probabilità di complicazioni ^2.

Nonostante anni di ricerca, i meccanismi alla base della formazione di aderenze sono ancora poco chiare. E 'noto che una lesione iniziale alla superficie peritoneale provoca un essudazione di liquido ricco di fibrina, che quindi forma un coagulo che lega le superfici di intestino e la parete addominale insieme ^3. Successivamente, fibroblasti e altre cellule migrano nello spazio adesivo e secernono tessuto connettivo ^4. Nel corso di mesi o anni l'adesione matura attraverso lo sviluppo di vasi sanguigni e nervi ^5.

Diversi prodotti commerciali esistono che sono progettati per ridurre la formazione di aderenze dopo l'intervento chirurgico addominale (ad esempio, Seprafilm). Tutti questi prodotti agiscono come barriere meccaniche e interrompere la formazione di aderenze impedendo il contatto fisico tra anse intestinali e ^6,7 parete addominale. Nonostante le prove da uno studio controllato che una barriera adesione chirurgica riduce la formazione di aderenze ^8, molti chirurghi anecdotally sono stati delusi con l'efficacia dei prodotti barriera meccanica.

Attualmente non ci sono terapie anti-adesione a base di droga, che riflette il fatto che i processi precisi coinvolti nella formazione di aderenze sono poco conosciuti. Lo sviluppo di una terapia che si rivolge specificamente agenti cellulari o molecolari coinvolti nella formazione di aderenze richiederà una migliore comprensione degli eventi che sono coinvolti nella formazione di adesione. Diversi gruppos hanno identificato percorsi molecolari che possono essere importanti per la formazione di aderenze ^9-11. Modelli animali forniscono un ambiente eccellente per studiare la formazione di aderenze. Molti studi sono stati pubblicati che descrive la creazione chirurgica di adesione in molti animali, soprattutto il ratto e nel topo ^6,12-14. Data la nostra esperienza con lo studio della fibrosi nel topo e l'ampia disponibilità di topi transgenici e gli anticorpi di topo-based, abbiamo scelto il topo come modello per lo studio di adesioni. Qui, si segnala la tecnica che abbiamo sviluppato per creare riproducibile e affidabile aderenze addominali nel topo.

Protocollo

Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale Stanford University cura degli animali e Usa (IACUC) e soddisfa tutte le linee guida etiche istituzionali per quanto riguarda l'uso di animali di ricerca.

1. Creazione di addominali aderenze

1. Avviare il mouse sulla dieta chow antibiotico una settimana prima della procedura.
2. Autoclave gli strumenti chirurgici e pre-caldo la soluzione di irrigazione salina.
3. Anestetizzare il mouse utilizzando 2% isoflurano per via inalatoria.
4. Utilizzando un tagliacapelli seguito da un breve applicazione (5 - 10 sec) di agente depilatorio, rimuovere i capelli dalla maggior parte della superficie dell'addome. Rimuovere accuratamente l'agente depilatorio strofinando delicatamente con una garza umida e, opzionalmente, da inzuppare con cura la parte inferiore del mouse in acqua calda. Asciugare accuratamente l'animale.
5. Posizionare muso dell'animale nel cono del naso anestetico. Durante l'intero intervento chirurgico, monitorare attentamente la rtasso espiratory dell'animale e titolare la portata anestetico, se necessario.
6. Utilizzare un dispositivo di riscaldamento, come ad esempio una piastra elettrica o una lampada di riscaldamento, per evitare l'ipotermia.
7. Prima preparando l'addome, fissare il mouse con strisce di nastro posti sopra e sotto l'addome per evitare che il mouse si sposti durante l'intervento chirurgico. Disinfettare l'addome con betadine, poi seguire con il 70% di etanolo. Include tanta zona possibile nella preparazione, compresi i capelli sui bordi della zona rasata. Posizionare un telino sterile sopra il mouse. (Figura 1)
8. Sottocutanea iniettare 0,1 mg / kg buprenorfina o 3 mg di 30 g mouse.
9. Rendere l'incisione cutanea.
   1. A partire dalla linea mediana addominale inferiore, afferrare la pelle con una pinza e fare un taglio verticale poco profondo nella pelle usando forbici affilate.
   2. Effettuare il taglio superiormente al xifoidea con le forbici. Fare attenzione a inserire solo la pelle.
10. Come la muscolatura addominale è nOW visibile che copre le viscere, afferrare la linea mediana della muscolatura con una pinza e con molta attenzione fare un piccolo taglio in esso usando forbici affilate. Assicurarsi di non tagliare accidentalmente in un organo addominale.
11. Dopo aver inserito spazio peritoneale con un piccolo taglio e vedere strato muscolare allontanarsi dagli organi addominali, estendere il taglio superiormente ed inferiormente inserendo le forbici nell'apertura e accuratamente taglio in entrambe le direzioni. Estendere l'incisione dal xifoidea superiormente al di sopra della vescica inferiormente. (Figura 2)
12. Ora che gli intestini sono esposti, individuare il cieco e delicatamente esteriorizzare esso. Evitare di afferrare il cieco con una pinza dentata o taglienti. Invece di utilizzare una pinza atraumatica come un Adson pinze dentellate.
13. Abrasivare il cieco con carta vetrata.
    1. raschiare delicatamente tutta la superficie di entrambi i lati del cieco con 100 carta abrasiva grana per 30-60 secondi fino a quando la superficie diventa meno lucida e petecchie appeaR sulla superficie. Se il chirurgo è destro, aiuta a orientare cieco con la punta rivolta verso destra e drappeggio cieco sopra il dito indice sinistro del chirurgo. (Figura 3)
    2. Eseguire la levigatura dolcemente, come è facile provocare accidentalmente una perforazione della parete cecal sottile. Una piccola quantità di granulosità deve essere sentito come la carta vetrata viene spostato lungo la superficie cecale. Se la carta vetrata è sentita più volte prendendo piede il cieco, questo probabilmente causerà una rottura nel muro del cieco. Guarda con attenzione per assicurare che le particelle di carta vetrata non sloggiare e rimangono nell'addome, in quanto ciò potrebbe causare un eccessivo reazione da corpo estraneo.
    3. Se si verifica una rottura nel muro cecal, chiudere il procedimento e l'eutanasia dell'animale.
    4. Se un vaso sanguigno del cieco viene tagliato dalla carta vetrata e provoca emorragie, mantenere la pressione per un massimo di due minuti con una garza. Tuttavia, se il sanguinamento persiste dopo questo tempo, mettere una figura di otto 7-0 monofilamento di sutura intorno alpunto di sanguinamento. Ciò affidabile fermare l'emorragia in quasi tutti i casi. Fare attenzione a non incorporare una grande quantità di parete cecal nella sutura, in quanto questo rischia di provocare necrosi della parte interessata del muro.
14. Ferire il diritto fianco addominale.
    1. Utilizzare una striscia di carta vetrata per abradere la superficie peritoneale del muscolo della parete laterale destra addominale. Sia più aggressivo con la levigatura qui che il cieco e continuare fino l'intera superficie della parete laterale destra addominale appare malmenato. Evitare di levigatura così forte che la pelle è visibile attraverso le aperture nello strato muscolare. (Figura 4)
    2. Utilizzando un driver ago Castro-Viejo, posto tra due e quattro otto figure-of-4-0 punti di sutura di seta nello strato muscolare della parete laterale addominale destra. Lasciare le code lunghe circa 5 mm. Fare attenzione a non catturare accidentalmente parete intestinale nella sutura. (Figura 5)
15. Usando una siringa da 10 ml riempita wesimo riscaldato soluzione salina, irrigare gli intestini più volte. Dirigere il flusso di soluzione salina nella cavità addominale per irrigare l'interno pure. Se la superficie sotto il mouse viene bagnato, spostare il mouse o sostituire la superficie, al fine di evitare l'ipotermia.
16. Utilizzare una garza sterile posto sopra l'incisione per assorbire l'irrigazione in eccesso.
17. Prendere una presa di amido e cospargerlo sulla superficie della parete laterale addominale destra e su entrambi i lati del cieco. (Figura 6)
18. Assicurarsi che non vi è alcun sanguinamento attivo. Se esiste, utilizzare una garza per applicare pressione direttamente sul punto di sanguinamento fino all'arresto. Se l'emorragia non si ferma immediatamente, posizionare una sutura emostatica come descritto sopra.
19. Con l'estremità smussata della pinza e un dito, spingere delicatamente l'intestino nella cavità addominale. Posizionare il cieco accanto alle suture nella parete laterale addominale destra al fine di massimizzare la formazione di aderenze.
20. Cperdere l'incisione addominale.
    1. Utilizzando 6-0 assorbibile sutura intrecciata, posizionare un punto in esecuzione nello strato muscolare nella parte superiore dell'incisione.
    2. Eseguire la sutura verso la parte inferiore dell'incisione, riunendo strato muscolare. Viaggiare in circa 3 mm e prendere 3 morsi mm con ogni nuovo punto. Fare attenzione a non prendere accidentalmente un morso di intestino pur ponendo suture.
    3. In fondo dell'incisione, lasciare un loop sutura dal morso precedente e utilizzare questo per strumento legare la sutura. Tagliare la sutura lasciando 5 mm code.
    4. Ripetere quanto sopra tre gradini con 6-0 monofilo di nylon di sutura per chiudere la pelle.
21. Somministrare un 20 ml / kg per via sottocutanea soluzione fisiologica in bolo (circa 0,5 ml per 30 g del mouse).
22. Usando una garza asciutta, asciugare accuratamente l'intero animale, come la pelliccia dorsale tende a bagnarsi durante l'irrigazione.
23. Liberamente avvolgere un adesivo vestire intorno all'addome per coprire l'incisione. Fare attenzione a non vincolare la unaLe gambe di Nimal o la meccanica di respirazione con il condimento.
24. Monitorare attentamente l'animale in quanto recupera da anestesia. Somministrare buprenorfina ogni 12 ore per 2-3 giorni dopo la procedura per il controllo del dolore.

2. La raccolta Adesione Tissue

1. Aspetta un minimo di sette giorni dopo l'intervento iniziale. Anche in questo caso, autoclave strumenti chirurgici e anestetizzare il mouse con isoflurano.
2. Sterilizzare l'addome con betadine seguito da 70% di etanolo. Shave e depilare capelli supplementari dal lato destro dell'addome in modo che il campione di adesione contenenti pelle non saranno coperti in capelli, che rende più difficile l'istologia.
3. Utilizzare una incisione paramediana sinistra, dal momento intestinale è spesso bloccato per l'incisione originale. Partendo all'estremità inferiore dell'addome, circa 5 mm a sinistra del fondo dell'incisione originale, afferrare la pelle con piccole pinze dentate e tagliare nella pelle con forbici affilate. Estendere questo taglio superiorely alla cassa toracica. (Figura 7)
4. Utilizzando le forbici, tagliare nello strato muscolare e dopo l'inserimento nello spazio peritoneale, estendere il taglio alla parte superiore e inferiore della incisione. Ci saranno tessuto adesivo causando cieco e nel piccolo intestino di aderire alla parete laterale destra dell'addome ed eventualmente anche per l'incisione originale. (Figura 8)
5. Utilizzando le forbici e iniziare sul bordo di incisione, di sopra del livello del cieco, inizia a tagliare nella parete addominale in cerchio attorno all'area in cui l'intestino è aderente.
6. Alternando sopra e sotto il livello del cieco, ridurre gradualmente tutto intorno l'adesione e completare il cerchio, ottenendo un "isola" della pelle e aderente parete addominale per l'intestino. (Figura 9)
7. Sempre con le forbici, tagliare nell'intestino e separare la parte aderente dal resto delle viscere, ottenendo un sandwich di tessuto che consiste di pelle e parete addominaleda un lato, intestino sull'altro lato, e il tessuto adesivo che li collega tra. (Figura 10)
8. Facoltativamente, utilizzare un paio di forbici a punta di separare nettamente la pelle dal muscolo parete addominale. Per l'istologia considerare lasciando la pelle allegata, ma per la digestione e l'isolamento delle cellule della pelle può essere rimosso. Se verrà utilizzato il tessuto per esame istologico, assicurarsi di rimuovere il materiale di sutura, per quanto possibile, senza disturbare troppo l'interfaccia adesivo. Per la digestione e l'isolamento di cellule è accettabile lasciare le suture in posizione fino a quando il tessuto digest viene filtrato.
9. Dopo ablazione del tessuto adesione, eutanasia il mouse mediante metodo umanitario approvati dal comitato istituzionale uso animale.

Risultati

A sette giorni dopo l'intervento, il cieco e, eventualmente, colon ascendente, il fegato, e loop di piccolo intestino dovrebbe essere aderente alla parete addominale lato destro. (Figura 8) tessuto asportato può essere integrato e sezionato e produrrà ottimi vetrini istologici. (Figura 11, 12)

Quando la procedura viene eseguita correttamente, il 100% dei topi dovrebbe avere adesioni ...

Discussione

I passaggi critici di questa procedura sono: accuratamente abrasione cieco senza provocare la perforazione, suture nella parete laterale addominale, e applicando la giusta quantità di amido. applica carta vetrata Solo al cieco, o per una piccola porzione specifica dell'intestino. Ampio uso di carta vetrata su grandi quantità di piccolo intestino tende a causare una significativa ileo. Fare attenzione a raschiare il cieco con forza sufficiente che la superficie diventa ruvida, ma non così tanto che le lacrime a muro....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fisherbrand Underpads assorbenti, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Campo sterile polifoderato, 18" x 24"	Busse Hospital Monouso:	696	Tagliare un foro rettangolare della dimensione appropriata
Isothesia isoflurane	Henry Schein
Fisherbrand Garza di cotone sterile, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Unguento oftalmico in vaselina Puralube, tubo da 1/8 oz.	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Crema depilatoria	Nair Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorfina  0,3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
Siringa da insulina da 1 cc, 27  G	Becton Dickinson	329412
preparazione dello iodio povidone	Medline	MDS093944H
Webcol tamponi per la preparazione dell'alcol	Covidien	6818
Nastro per etichettatura Labarotory per uso generico	VWR	89097-912
Guanti chirurgici BioGel PI	Mö lnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Pinze con denti	Roboz	RS-5150
Forbici fini - affilate	Fine Science Tools	14060-09
Pinze seghettate diritte	Fine Science Tools	11050-10
Cacciavite ad ago Castro-Viejo	Fine Science Tools	12565-14
100 grana 1/4 foglio di carta vetrata	ACE Hardware	1010446	Tagliare a strisce
4-0 sutura di seta, 30", ago SH	Ethicon	K831
7-0 PDS II sutura monofilamento assorbibile, 30", ago BV-1	Ethicon	Z135	Di solito viene fornito a doppio braccio. Tagliare la sutura a metà strada per generare due suture utilizzabili.
Amido di riso	MP Biomedicals	102955
0,9% cloruro di sodio irrigazione	Baxter	BHL2F7121	caldo a 37 gradi C prima dell'uso
siringa da 10 ml	Becton Dickinson	309604
6-0 Vicryl sutura intrecciata assorbibile, 18", RB-1 ago conico	Ethicon	J212H
6-0 Ethilon nylon monofilamento  sutura, 18", ago P-3,	Ethicon	1698G
Tegaderm Pellicola Trasparente Dressing Frame Style, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Taglio a metà nel senso della lunghezza

050033 Soluzione per la