Articolo metodologico

Rilevamento del pH-dipendente attività di

DOI:

10.3791/54527

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23 ottobre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

In questo articolo

Sommario

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Questo studio descrive le tecniche biofisiche, biochimiche e molecolari per caratterizzare l'attività chaperone di Escherichia coli HdeB in condizioni di pH acido. Questi metodi sono stati applicati con successo per altri accompagnatori acido-protettivi come HdeA e può essere modificato a lavorare per altri accompagnatori e condizioni di stress.

Abstract

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I batteri sono spesso esposti ai cambiamenti ambientali, come ad esempio le alterazioni di pH, la temperatura, lo stato redox, l'esposizione alla luce o forza meccanica. Molte di queste condizioni causare proteine ​​dispiegarsi nella cella e avere un impatto negativo sulla sopravvivenza dell'organismo. Un gruppo di, chaperon molecolari indipendenti specifici di stress hanno dimostrato di svolgere un ruolo essenziale per la sopravvivenza di queste condizioni di stress. Mentre completamente piegata e chaperone-inattivo prima dello stress, queste proteine ​​rapidamente svolgersi e diventare chaperone-attiva in condizioni di stress particolari. Una volta attivato, questi chaperon condizionatamente disordinati legano ad un gran numero di differenti proteine ​​di aggregazione-inclini, prevenire la loro aggregazione e direttamente o indirettamente facilitare proteina ripiegamento su ritorno a condizioni di non-stress. L'approccio principale per ottenere una comprensione più dettagliata del meccanismo della loro attivazione e cliente riconoscimento comporta la purificazione e subsequent caratterizzazione di queste proteine mediante saggi in vitro chaperone. Follow-up in saggi di stress in vivo sono assolutamente essenziali per confermare in modo indipendente l'ottenuto dei risultati in vitro.

Questo protocollo descrive in vitro e in vivo metodi per caratterizzare l'attività chaperone di E. coli HdeB, un chaperone acido attivato. Misure di light scattering stati usati come una comoda lettura per la capacità di HdeB per prevenire l'aggregazione indotta da acido di un consolidato proteine client modello, MDH, in vitro. esperimenti ultracentrifugazione analitici sono stati applicati per rivelare la formazione di complesso tra HdeB e la sua LDH proteine ​​cliente, di fare luce sulla sorte di proteine ​​clienti al loro ritorno a condizioni di non-stress. saggi di attività enzimatica della proteine ​​clienti sono stati condotti per monitorare gli effetti della HdeB sul pH indotta inattivazione del cliente e la riattivazione. Infine, studi di sopravvivenza sono stati usati per Monitor l'influenza della funzione di accompagnatore di HdeB in vivo.

Introduzione

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Un ambiente naturale comune in cui gli agenti patogeni microbici sperimentano proteine condizioni dispiegarsi acido-indotta è lo stomaco dei mammiferi (intervallo di pH 1-4), il cui pH acido serve come una barriera efficace contro gli agenti patogeni di origine alimentare 1. Proteine dispiegarsi e aggregazione, che è causato da protonazione catena laterale di aminoacidi, colpisce processi biologici, danni strutture cellulari e alla fine provoca la morte delle cellule 1,2. Poiché il pH del periplasma batterico equilibra quasi istantaneamente con il pH ambientale dovuto alla diffusione libera di protoni attraverso la membrana esterna porosa, prote....

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Protocollo

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1. Espressione e purificazione di periplasmic HdeB

NOTA: HdeB è stato espresso in E. coli che ospitano il plasmide pTrc- hdeB 10, e purificato dal periplasma su polimixina lisi.

  1. Preparare una cultura durante la notte di E. coli che ospitano il plasmide pTrc- hdeB 10 a 30 ml di LB contenente 200 mg / ml di ampicillina (LB Amp). Seminare quattro 1 L culture di LB Amp e crescere a 37 ° C e 200 rpm fino a raggiungere OD 600nm di 0,7. Quindi, aggiungere 300 mM IPTG per indurre l'espressione di HdeB e diminuire la temperatura di crescita a 30 ° C.
  2. Dop....

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Risultati

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HdeA e HdeB sono omologhi E. proteine coli, noto per proteggere le proteine periplasmatiche contro condizioni di stress acido 10. Il nostro lavoro ha rivelato che simile a HdeA, HdeB funziona anche come un acido attivato chaperone molecolare. Tuttavia, a differenza di funzioni HdeA, HdeB ad un pH che è ancora potenzialmente battericida, ma significativamente superiore al pH ottimale di HdeA 6,9,10,22. Per studiare il pH ottimale di attività chapero.......

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Discussione

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Per studiare il meccanismo di attivazione e funzione chaperone di HdeB, grandi quantità di HdeB devono essere espresse e purificate. Un certo numero di sistemi di vettori di espressione sono disponibili per la produzione di alti livelli di una proteina bersaglio, comprese PTRC o pBAD vettori, entrambi i quali sono stati utilizzati in questo studio. I promotori sono facilmente accessibili per E. coli RNA polimerasi e l'espressione permettere così fortemente upregulated di HdeB in qualsiasi E. coli........

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Claudia Cremers per lei consigli utili su saggi chaperone. Ken Wan è riconosciuto per la sua assistenza tecnica nella purificazione HdeB. Questo lavoro è stato sostenuto dal Howard Hughes Medical Institute (a JCAB) e il National Institutes of Health sovvenzione RO1 GM102829 a JCAB e Ujj-UD è supportato da una borsa di ricerca post-dottorato fornita dalla German Research Foundation (DFG).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NEB10-beta E. coli celluleNew England BiolabsC3019I
AmpicillinaGold BiotechnologyA-301-3
LB Miscela di brodo, LennoxLAB Express3003
IPTGGold BiotechnologyI2481C50
Cloruro di sodioFisher ScientificS271-10
TrisAmresco0826-5kg
EDTAFisher ScientificBP120-500
Polimixina B solfato ICN Biomedicals Inc.
0,2 µ Filtro per siringa sterile a porim Corning431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)GE Healthcare Life Sciences17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%Bio-Rad4561046
Malato deidrogenasi (MDH)Roche10127914001
Potassio fosfato (monobasico)Fisher ScientificBP362-500
Potassio fosfato (bibasico)Fisher ScientificBP363-1
F-4500 spettrofotometro a fluorescenzaHitachiFL25
OxaloacetateSigmaO4126-5G
NADHSigma N8129-100MG
Sodio fosfato monobasicoSigmaS9390-2.5KG
Sodio fosfato bibasicoSigmaS397-500
Lattato deidrogenasi (LDH)Roche10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analitico UltracentrifugaBeckman Coulter392764
Centrotavola, 12 mm, Epon Charcoal-filledBeckman Coulter306493
AN-50 Ti Rotor, analitico, 8 postiBeckman Coulter363782
Wizard Plus Miniprep KitPromegaA1470utilizzato per la purificazione dei plasmidi (Protocollo 5.1)
L-arabinosioGold BiotechnologyA-300-500
GlycineDOT Scientific IncDSG36050-1000
Cuvetta cellulare a fluorescenzaHellma Analytics119004F-10-40
OligonucleotidiInvitrogen
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltàNew England BiolabsM0530S
dNTP setInvitrogen10297018
acido cloridricoFisher ScientificA144-212
Idrossido di sodioFisher ScientificBP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWLMilliporeUFC900324
Centrifuga Avanti J-26XPIBeckman Coulter393127
spettrofotometro Varian Cary 50Agilent Tech
Spectra/Por 1 membrana per dialisi MWCO: 6 kDaSpectrum Laboratories132650
Unità filtranti ultra centrifughe Amicon 30KMilliporeUFC803024
SDSFisher Scientificbp166-500
Veriti Termociclatore a 96 pozzettiThermo Fisher4375786
100565

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in....

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Chaperone HdeBsaggio di diffusione della lucechaperone in vitrosopravvivenza in vivochaperone attivato da acidoaggregazione proteicamalato deidrogenasisaggi di sopravvivenza

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